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鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii,Ab）是一种革兰阴性非发酵杆菌,广泛分布于水和土壤、医院环境、人体腔道及皮肤表面,为院内感染菌中,检出率仅次于铜绿假单胞菌的条件致病菌。鲍曼不动杆菌对常规消毒处理具有较强的抵抗力,紫外线和一般消毒剂仅能抑制其生长,不能将其杀灭[1],因此,鲍曼不动杆菌常藏匿于各种医疗器械及医院病房角落,对于重症患者,如老年患者、危重疾病及机体抵抗力弱的患者,以及使用各种侵入性操作和长期使用广谱抗生素治疗的患者来说,鲍曼不动杆菌可成为重要的致病菌[2-4]。随着广谱抗生素、激素、免疫抑制剂及各种侵入性治疗的的广泛应用,在抗生素筛选压力下,近年来在国内外出现了多重耐药（Multi-Drug Resistance）,甚至泛耐药（Pan-Drug Resistance）鲍曼不动杆菌。泛耐药鲍曼不动杆菌（Pan-Drug Resistance Acinetobacter baumanii）对FDA推荐的所有用于治疗Ab感染的抗生素耐药,包括头孢菌素类、碳青霉烯类、beta-内酰胺酶抑制剂、氟喹诺酮类和氨基糖苷类。鲍曼不动杆菌几乎能够入侵人体的各个器官和系统,引起医院获得性肺炎、泌尿生殖系统感染、伤口及皮肤感染、化脓性关节炎、骨髓炎、腹膜炎,严重时引发严重败血症甚至死亡[5-6],直接威胁国人的身体健康和公共卫生安全。加强对鲍曼不动杆菌感染的防治研究已迫在眉睫,研制安全、有效的新型鲍曼不动杆菌疫苗将对有效控制鲍曼不动杆菌耐药性蔓延和临床鲍曼不动杆菌广泛感染具有重大应用价值。针对目前鲍曼不动杆菌临床上耐药性急剧上升的状况,利用鲍曼不动杆菌的免疫原性,诱导机体产生有效的抗鲍曼不动杆菌免疫反应,是防治鲍曼不动杆菌感染的一个新策略。目前针尚未有上市的或进入临床实验的鲍曼不动杆菌疫苗的研究,但是实验室研究已经取得一些令人鼓舞的结果刚处于起步阶段,如灭活的全菌疫苗[7-8],外膜蛋白A（Omp A,最初称为Omp 38）[9-10],外膜复合物[11],外膜小泡[12],生物膜相关蛋白[13]等疫苗均显示具有较好的免疫原性,可有效诱导机体产生免疫反应。然而目前的研究采用的全菌灭活疫苗及外膜复合物等,其成分比较复杂,可能含有效的保护性抗原成分,也可能存在与免疫保护无关或者副作用的成分,且制备过程难以标准化,而基因工程亚单位疫苗抗原成分明确,效果明确,副作用小,安全性高,是一种理想的疫苗形式。鲍曼不动杆菌感染致病存在多个环节,包括细菌的粘附,定植以及毒力因子释放等环节。因此,理想的鲍曼不动杆菌疫苗应含有分泌性毒素抗原或定植粘附相关的蛋白,并且暴露于细菌表面,可以被免疫系统有效的识别,能够有效刺激宿主产生保护性抗体,以发挥其调理吞噬或中和毒素的作用,保护宿主免于鲍曼不动杆菌感染。此外,在制备抗原时,应去除蛋白与免疫原性无关的冗余成分,降低机体的毒副反应。。因此,筛选鉴定有效的保护性抗原,是成功研制鲍曼不动杆菌基因工程疫苗的前提和关键。【研究目的】课题组前期通过反向疫苗学策略及生物信息学分析,从鲍曼不动杆菌全基因组中筛选到了多个具有潜在免疫优势的疫苗候选抗原。其中,A1S0115为鲍曼不动杆菌一个功能未知的外膜蛋白,且具有良好的保守性和特异性,为了实验研究该蛋白的免疫原性及免疫保护性,探讨该蛋白作为鲍曼不动杆菌疫苗候选抗原的可能性,本研究通过基因克隆及表达鲍曼不动杆菌A1S0115蛋白胞外区（A1S0115A）活性片段作为疫苗的候选抗原,评价该抗原在小鼠全身鲍曼不动杆菌感染动物模型中的免疫保护作用,同时对该候选抗原诱导产生免疫保护的作用机制进行了初步研究。以期为新型、有效的鲍曼不动杆菌基因工程疫苗的分子设计,抗原选择,以及后续的重组亚单位疫苗研究奠定实验基础与理论指导。【研究方法】1.从鲍曼不动杆菌国际标准株ATCC 17978中提取细菌基因组作为PCR的模板,经生物信息学分析后,通过PCR扩增鲍曼不动杆菌A1S0115胞外区活性片段（命名为:A1S0115A）,同时引入酶切位点Bam H I与Not I。目的基因双酶切后的回收产物与p GEX-6P-2表达载体相连,转化到Escherichia coli XL-1 blue菌株,在IPTG的诱导下表达GST融合蛋白,经GST亲和填料初纯、柱层析精纯及去内毒素后,检测蛋白终产物的纯度并进行SDS-PAGE电泳分析。2.为评价候选疫苗抗原A1S0115A的免疫原性,采用ELISA在免疫后的不同时间点检测了候选疫苗抗原诱导产生的特异性抗体水平及其亚型,并绘制抗体消长曲线。3.为评价候选疫苗抗原A1S0115A的免疫保护作用,在通过腹腔感染鲍曼不动杆菌标准株ATCC 17978,建立BALB/c小鼠脓毒血症动物模型基础上,将候选疫苗抗原A1S0115A与Al（OH）3佐剂吸附后免疫BALB/c小鼠,并用组氨酸疫苗稀释液及Al（OH）3佐剂作为空白对照及佐剂对照。小鼠在末次免疫后两周,用LD80剂量的鲍曼不动杆菌17978菌株（4.2×108CFU）感染小鼠,在细菌攻毒后的7天监测小鼠的死亡情况,并计算免疫保护率,同时监测感染后各脏器的细菌定植量与病理损伤。4.为初步研究候选疫苗抗原A1S0115A的免疫保护作用机制,体外检测了特异性抗体介导的调理吞噬杀菌作用,体内评价A1S0115A特异性抗体的被动免疫保护效果。同时检测了免疫小鼠在感染鲍曼不动杆菌后血清中的促炎因子（IL-1β、GM-CSF）及脾细胞中细胞因子（IFN-γ,IL-4）的表达水平。【研究结果】1.成功构建基因工程菌p GEX-6P-2-A1S0115A/XL-1blue,经IPTG诱导后,候选疫苗蛋白A1S0115A以可溶形式表达在工程菌胞周质中,经GST亲和填料初纯、柱层析精纯及去内毒素后,目的蛋白纯度高于95%,SDS-PAGE分析其蛋白分子量与预期大小一致。2.候选疫苗抗原A1S0115A以D0、D7、D14的免疫程序免疫BALB/c小鼠后,小鼠产生了特异的的体液免疫应答反应,诱导产生的抗体效价为1:256000,特异性抗体亚型主要以Ig G1为主。在末次免疫后3个月的检测时间内,A1S0115A特异性抗体水平逐步上升并保持稳定,具有相对良好的免疫持久性。3.采用已建立的鲍曼不动杆菌感染BALB/c小鼠的脓毒血症动物模型,将A1S0115A候选疫苗免疫小鼠后,LD80致死剂量的鲍曼不动杆菌进行攻毒感染,与佐剂对照组和空白对照组相比,免疫组小鼠的生存率明显提高,其保护率存在显著的统计学差异（p<0.05）;各脏器的细菌定植量检测与病理损伤结果表明,疫苗能显著减少感染细菌在脾脏,肾脏,心脏,肝脏,肺脏中的定植,同时免疫组小鼠的病理损伤和组织炎症浸润亦低于对照组,免疫组小鼠的临床评分明显高于各对照组。4.体内外的抗体活性及功能检测结果表明:纯化的特异性A1S0115A抗体在体外对鲍曼不动杆菌具有明显的调理吞噬杀菌作用,在体内对鲍曼不动杆菌的感染具有良好的被动免疫保护效果。免疫小鼠在感染鲍曼不动杆菌后的细胞因子检测结果表明:疫苗组脾细胞的IFN-γ及IL-4表达水平明显高于各对照组（p<0.05）,而血清中的促炎因子IL-1β及GM-CSF表达水平,疫苗组较各对照组相比则显著降低（p<0.05）。【结论】1.成功构建p GEX-6P-2-A1S0115A/XL-1blue基因工程菌,并表达制备了高纯度的鲍曼不动杆菌候选疫苗抗原A1S0115A。该抗原免疫小鼠后诱导机体产生了高效价的保护性抗体,对于致死剂量的鲍曼不动杆菌感染具有良好的免疫保护作用。表明该候选抗原具有良好的免疫原性及免疫保护性。2.初步的免疫保护作用机制研究结果表明:该候选疫苗抗原免疫后可刺激机体产生特异的保护性体液免疫应答及细胞免疫应答,有效地抑制了鲍曼不动杆菌感染所产生的促炎因子表达,保护了鲍曼不动杆菌感染所引起的脓毒血症休克及死亡。3.本研究为新型、有效鲍曼不动杆菌基因工程疫苗的抗原选择、分子设计、免疫保护评价探索了较系统的研究思路和技术方案,为后续进一步研发鲍曼不动杆菌重组多价亚单位疫苗提供了坚实的实验基础与理论指导。