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研究背景：
半月板损伤是一种临床常见的关节疾病，随着人口的增长以及竞技运动的普及开展，半月板损伤发病率也日趋上升。目前临床上治疗主要为半月板修补、半月板切除及半月板移植术，他们有各自的适应症，而利用组织工程技术构建有功能的半月板以防治半月板切除术后发生膝关节骨性关节炎等严重并发症，则为半月板损伤的治疗提供了新思路。间充质干细胞(MSCs)因来源广泛具有多分化潜能，增殖能力强，取材方便，分离、培养相对简单，免疫反应低，而成为组织工程重要的种子细胞。转化生长因子-β<,1> (TGF-β<,1>)可诱导MSCs分化为软骨细胞，维持软骨细胞表型，是MSCs定向分化的最重要的生长因子之一。目前基因转染的载体有很多种，腺相关病毒载体(AAV)由于可介导外源基因的长期表达、免疫原性弱、宿主范围广等特点，已成为目前公认的理想病毒载体。左旋聚乳酸与聚己内酯作为高分子材料，具有高强度、降解速率慢等特点，已广泛用于组织工程及临床上，但是此类材料缺乏对细胞的特异性粘附。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)是细胞外基质中粘附蛋白的活性短肽序列，是许多细胞表面某些整合素特异性配体之一，是目前应用最广泛，且被证明最有效的促粘附多肽。研究表明，纳米尺度可控制与基质接触的细胞粘附和基因表达，具有纳米结构的生物支架材料有利于细胞的粘附、增殖和功能的增强。因此，有必要探讨这几种因素在半月板组织工程中的应用。
研究目的：
探讨将构建TGF-β<,1>的腺相关病毒转染MSCs，诱导其成为软骨样细胞；以可降解且具有良好生物力学性质并经过RGD短肽修饰的具有纳米结构的PCL-b-PLLA为半月板的支架材料；体外进行半月板三维构建的可行性。期望构建出具有良好生物学性能的组织工程半月板，为其进一步应用于体内试验及临床初步应用提供理论依据及奠定基础。
材料和方法：
1．取犬骨髓应用密度梯度离心法及贴壁筛选法分离培养MSCs，倒置显微镜及Giemsa染色观察细胞形态，透射电镜观察细胞超微结构，流式细胞仪检测其表面标记物，在诱导剂作用下进行MSCs成骨诱导分化，并进行碱性磷酸酶染色。
2．取第三代犬MSCs，以MOI为10<'4>～10<'5>v．g．/cell的rAAV1-EGFP和rAAV2-EGFP进行转染，3d、7d、2ld后荧光显微镜观察检测转染效率；MTT法检测rAAV1-EGFP和rAAV2-EGFP对MSCs的毒性作用。
培养正常人成骨细胞，提取总RNA，R1-PCR方法获得hTGF-β<,1>的编码基因。将该片段克隆到腺相关病毒载体pSNAV，将重组质粒应用脂质体法转染BHK-21细胞，用rAAV2包装辅助病毒HSV1-rc/△UL2感染包装，并经“氯仿处理/PEG-NaCl沉淀/氯仿抽提”法纯化病毒颗粒，获得成熟的重组腺相关病毒体。SDS-PAGE检查腺相关病毒外壳蛋白和纯度分析。DNA斑点杂交法进行病毒滴度测定。PCR方法确认重组病毒体所携带的hTGF-β<,1>编码基因。透射电镜观察病毒颗粒形态。
取第三代犬MSCs，以MOI=5×10<'5>(v．g．/cell)及1×10<'5>(v．g．/cell)rAAV2-hTGF-β<,1>进行转染；未转染对照组；2w后，RT-PCR检测Ⅱ型胶原、AggrecanmRNA的表达，免疫细胞化学法检测Ⅱ型胶原的表达；转染10d后，Westem blot检测hTGF-β<,1>的表达；分别于3、6、9d， ELISA法检测hTGF-β<,1>的含量。
3．取第三代犬MSCs接种至PCL-b-PLLA膜及RGD修饰的PCL-b-PLLA膜，于2h、4h、6h分别计数细胞检测细胞粘附率；培养3d后，通过倒置显微镜、Hoechst33342荧光法及扫描电镜观察细胞的形态与粘附状况；培养24h后，MTT法检测细胞毒性；于2d、4d、6d MTT法检测细胞增殖情况。
开环聚合制备PCL-b-PLLA，液．液相分离制备．PCL-b-PLLA纳米支架，固一液相分离制备PCL-b-PLLA支架，扫描电镜观察材料结构；体外降解试验检测纳米支架的降解率，生物力学试验检测其压缩强度。取第三代犬软骨细胞接种至PCL-6-PLLA支架(对照组)及纳米结构PCL-b-PLLA支架(实验组)进行三维培养。6d后扫描电镜观察细胞的形态与粘附状况；于3d，6d，12d，应用Hoechst33258荧光法检测复合物中细胞DNA含量、BCA法测定蛋白质含量。
取第三代犬MSCs，以MOI=5×10<'5>(v．g．/cell)rAAV2-hTGF-β<,1>进行转染；细胞培养7d后，以5×10<'6>个/支架密度接种于RGD修饰的纳米结构PCL-b-PLLA支架上继续培养。分别于4w及8w进行大体观察，HE染色、阿尔新蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组化进行组织学观查。
结果：
1.原代及传代培养的MSC呈现梭形外观，具有较强的增殖能力。MSCs超微结构显示其胞体较小，细胞核/浆比例大，胞核呈圆形或椭圆形，胞浆少，染色质较疏松的，表现出早期细胞的特点。细胞表面抗原CD29、CD44和CD105表达阳性，CD34、CD45表达阴性。MSCs诱导分化后细胞表现成骨细胞特性，碱性磷酸酶染色阳性。
2．随MOI的增加及时间的延长，rAAV1-EGFP、rAAV2-EGFP对犬MSCs的转染效率逐渐增加，rAAV2-EGFP转染效率明显高于rAAV1-EGFP(p<0．01)。转染MSCs细胞后，细胞生长正常，MTT法显示各转染组与未转染组的OD值无统计学差异(p>0．05)。
载体构建完毕后，经过酶切鉴定，测序与基因库中的目的基因的序列做比对，证明我们装载到载体多克隆位点的基因序列完全正确。SDS-PAGE示病毒衣壳蛋白的3条特征性条带明显，rAAV的纯度>95％。测其物理滴度达1×10<'12>v．g/mL。病毒原液PCR检测证明所包装的rAAV2携带有我们所需的hTGF-β<,1>基因。rAAV病毒的透射电镜可看见小而均一且完整的实心病毒颗粒。
rAAV2-hTGF-β<,1>转染MSCs 2w后，RT-PCR示Ⅱ型胶原、Aggrecan mRNA均表达；免疫细胞化学示Ⅱ型胶原表达，5×10<'5>(v．g．/cell)组表达量高于1×10<'5>(v．g．/cell)组。10d后，Western blot示hTGF-β<,1>的表达，5×10<'5>(v．g．/cell)组高于1×10<'5>(v．g．/cell)组。ELISA法检测示，随时间延长，转染组hTGF-β<,1>含量亦增高，两组之间差异有统计学意义(P<0．01)。
3．MSCs在RGD修饰PCL-b-PLLA膜上粘附、增殖良好，无明显细胞凋亡及坏死。于2h、4h、6h时RGD修饰PCL-b-PLLA膜的细胞粘附率明显高于PCL-b-PLLA膜组(P<0．05)，两组膜均对细胞无毒性(P>0．05)。MSCs在RGD修饰PCL-b-PLLA膜上细胞增殖快。
纳米结构支架材料相对分子量150 kD，压缩强度为72．6KPa，支架降解率较慢，孔隙率为93％。扫描电镜示纳米PLLA-b-PCL表面为多孔状，孔径为200-300um，孔隙分布均匀，孔隙间相互连通，孔壁为纤维网状连接，纤维直径为150-350um。非纳米结构支架扫描电镜示支架表面亦呈多孔状，孔隙大小不甚均匀，孔隙率为86％。扫描电镜示，软骨细胞与支架复合培养6d，纳米结构支架可见孔隙内细胞覆盖材料，细胞间相互连接，分泌大量基质；非纳米结构支架细胞连接不紧密，细胞外基质分泌较少。随时间延长软骨细胞在支架材料上DNA和蛋白质含量逐渐增加，DNA和蛋白质含量均明显高于对照组(P<0．01)。
转染后的MSCs与RGD修饰的纳米结构PCL-b-PLLA支架复合培养，4w时大体观察示复合物大小无明显变化，表面光泽不明显，硬度与未接种支架相同。HE染色示细胞长入材料内，分泌基质，材料无降解；阿尔新蓝染色示基质蓝染，着色较淡；免疫组化示Ⅱ型胶原染色呈阳性。8w大体观察可见复合物呈软骨状，表面较光滑，有光泽，大小形状无明显改变，硬度与未接种支架大体相似。HE染色示大量细胞长入材料内，细胞数量明显增多，分泌大量基质，支架材料少量降解。阿尔新蓝染色示大量基质蓝染，着色较深；免疫组化示Ⅱ型胶原染色呈强阳性；说明随时间延长，细胞基质合成、分泌能力增强。
结论：1．采用梯度离心法和体外细胞贴壁分离培养法相结合对犬骨髓间充质干细胞进行分离、纯化、培养是可行的。
2．rAAV2载体转染MSCs比rAAV1载体具有更高转染效率。
3．rAAV2-hTGF-β<,1>转染MSCs可诱导其分化为软骨细胞。
4．PCL-b-PLLA无细胞毒性，RGD修饰的PCL-6-PLLA有利于细胞粘附、增殖。
5．纳米结构PCL-b-PLLA支架有利于细胞粘附、增殖及代谢。
6．rAAV2-hTGF-β<,1>转染MSCs复合RGD修饰PCL-b-PLLA纳米结构支架可在体外成功构建出软骨。