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在不同物种中，直系同源基因通常被认为在功能上保守，也就是“直系同源-功能推测”（orthology-function conjecture）假说。然而，对于大型基因家族的直系同源基因，该假说却面临挑战。本论文以一大型基因家族“谷胱苷肽转移酶(GST)”为例，探讨大型基因家族的直系同源基因功能分化/保守的分子机制。GST在植物抗逆和解毒过程中发挥重要作用。通过对杨树三个近缘物种“胡杨、亚东杨和毛果杨”的GST基因分析，并鉴定直系同源基因。综合运用系统进化、基因表达、蛋白酶学及晶体结构等方面的分析，探讨了杨树直系同源GST基因的功能分化模式及分子机制，获得结果如下: 1、从胡杨和亚东杨中分别克隆得到了42个和59个GST基因，与毛果杨的GST基因一同构建系统发育树，鉴定获得15组直系同源GST基因。运用slidingwindow的方法对15组直系同源基因的编码区进行选择压力分析发现，有12组直系同源GST基因存在Ka/Ks＞1的区域，说明在基因不同的编码区域存在着正选择位点。 2、对不同胁迫条件不同部位的表达模式分析表明，15组直系同源GST基因中有10组存在表达的分化。而这10组基因的分化表现出两种模式:(a)直系同源基因在两个物种中有相同的表达，而在另一个物种中存在着表达分化;(b)直系同源基因在三个物种中都有不同的表达模式。 3、通过对9组直系同源蛋白的酶学性质进行测定，发现直系同源蛋白之间普遍存在着生化功能的分化，包括底物特异性以及酶学活性的分化。根据直系同源蛋白的酶学性质，发现三种不同类型的分化:(a)直系同源蛋白间表现出相似的底物谱，但酶学活性有差异;(b)直系同源基因组内两个蛋白底物谱相似，而另一个蛋白具有不同的底物谱;(c)直系同源蛋白间有部分重叠的底物谱。此外，蛋白的动力学结果显示直系同源蛋白的Km值以及Kcat/Km值都表现出差异，这表明直系同源蛋白对于底物的亲和力以及催化效率都发生了分化。 4、为了探讨直系同源基因的功能分化机制，本论文构建了20个PeGSTU30和PtGSTU30的单个位点氨基酸突变的突变体蛋白，通过酶学功能分析发现39位的氨基酸变异显著贡献于PeGSTU30与PtGSTU30蛋白的功能分化，而且该位点位于正选择区域，是可能的正选择位点。进一步对PtGSTU30的R39W突变位点的作用机制研究发现，色氨酸残基能够提高蛋白对底物的亲和力以及催化效率。 5、通过对PtGSTU30及R39W突变体蛋白的晶体结构分析发现，PtGSTU30及R39W突变体蛋白具有典型的GST三维结构，且G位点非常保守。R39W突变体蛋白三维结构显示39位色氨酸位于活性中心附近，通过与邻近蛋白的疏水相互作用，改变了GSH的结合位置，并且使得活性口袋的开口变小而蛋白表面疏水性增加。这说明直系同源基因的生化功能分化是通过少数关键氨基酸位点的变化而导致的。 综合分子进化分析、基因表达模式、酶学特性、定点突变以及晶体结构等数据，本论文发现三种杨树GST基因家族直系同源基因存在功能分化，并系统性地阐述了其功能分化的模式和机制，为理解近缘物种中大型基因家族的进化机制提供了新的视角。