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第一部分小鼠脊髓原代星形胶质细胞培养方法的建立目的:探索小鼠脊髓原代星形胶质细胞的分离、纯化及体外培养方法,为ALS的进一步研究提供一种模型。方法:采用小鼠脊髓星形胶质细胞的原代培养和传代培养。无菌条件下取生后1～3天ICR(Institute of Cancer Research)小鼠的脊髓,剪碎后胰酶分次消化,结合机械吹打使细胞分散,制成单细胞悬液,接种于无底物黏附的玻璃培养瓶中,置37℃,5%CO2培养箱中培养。培养液为DMEM/F12混合培养液。培养9～12天,待细胞达到80%～90%融合后进行摇床纯化,舍弃含脱落细胞的细胞悬液,以去除少突胶质细胞和小胶质细胞,继续培养,待细胞铺满瓶底后传代,并对传代细胞进行形态观察和星形胶质细胞的免疫荧光鉴定。结果:通过恒温震荡和传代后得到了形态典型,含量较高的脊髓源性星形胶质细胞。GFAP免疫细胞化学染色阳性细胞可高达98%。结论:体外培养的小鼠脊髓星形胶质细胞可以作为研究星形胶质细胞损伤保护因素的理想模型,GFAP能够特异性标记小鼠脊髓星形胶质细胞。第二部分EGCG对过氧化氢诱导的星形胶质细胞氧化损伤的保护作用目的:研究EGCG对过氧化氢诱导的星形胶质细胞氧化应激性损伤的保护作用及其作用机理。方法:在原代小鼠脊髓星形胶质细胞培养的基础上,取第三代培养物用于实验,将细胞随机分为①正常对照组:普通DMEM培养液;②EGCG处理组:分为1、5、10、20和50μmol/L 5个药物浓度,分别加入含有相应药物浓度的培养液,处理24小时后进行细胞活力测定。最后选用5μmol/L和10μmol/L的药物浓度用于下一步实验,再将细胞随机分为①正常对照组:普通DMEM培养液;②H2O2损伤组:DMEM培养液中加入H2O2(终浓度为25μmol/L),继续培养1小时;③5μmol/L EGCG预处理组:给予5μmol/L EGCG,预处理24小时,然后与H2O2损伤组一起加入H2O2(终浓度为25μmol/L)溶液,继续培养1小时④10μmol/L EGCG预处理组:给予10μmol/L EGCG,预处理24小时,然后与H2O2损伤组一起加入H2O2(终浓度为25μmol/L)溶液,继续培养1小时,作用完全后收集各组培养液及细胞,采用LDH、Western blot免疫印迹技术,测定培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的含量及GFAP,NQO1的蛋白表达变化情况。同时用10μmol/L EGCG作用于正常的星形胶质细胞,24小时后收集细胞,用Western blot免疫印迹技术测定NQO1的改变。结果:EGCG在1、5、10、20、50μmol/L的浓度范围内对星形胶质细胞无毒且可以使细胞活力增加,但较低浓度1、5、10μmol/L组效果更好,与正常对照组相比,具有统计学意义(P<0.05)。倒置相差显微镜下观察,正常对照组星形胶质细胞形态正常;H2O2损伤组主要的形态改变为细胞肿胀,折光性增强,胞质变少,变的透明,胞核浓缩突出,细胞突起回缩;而给予10μmol/L EGCG预处理24小时后加入H2O2,星形胶质细胞形态变化不大,细胞突起清晰可见,胞体立体感较好。H2O2损伤组与对照组相比培养液中LDH逸漏增加,差异有统计学意义(P<0.05);与损伤组相比,经5μmol/L或10μmol/L的EGCG提前24小时干预,可使培养液中LDH含量明显下降,差异有统计学意义(P<0.05);H2O2损伤组与对照组相比抗氧化酶NQO1蛋白表达下降,细胞活性下降,GFAP蛋白表达减少(P<0.05,P<0.05),而经5μmol/L或10μmol/L EGCG提前24小时干预,与损伤组相比,NQO1和GFAP的蛋白表达明显增加(P<0.05,P<0.05)。10μmol/L EGCG作用正常的星形胶质细胞,可以上调抗氧化酶NQO1的蛋白表达水平(P<0.05)。结论:EGCG可明显诱导小鼠脊髓星形胶质细胞Nrf2/ARE通路下游的抗氧化酶NQO1的表达。NQO1表达上调,对于抵抗小鼠脊髓星形胶质细胞氧化损伤发挥了一定作用,推测EGCG可能通过激活Nrf2/ARE通路而诱导了下游一系列靶基因的表达上调,它们协同起来加强了组织的抗氧化能力,进而发挥了神经保护作用。EGCG在肌萎缩侧索硬化(ALS)等神经变性疾病的防治上有一定的应用前景。