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目的:
梗阻性肾病(obstructive nephropathy,ON)是泌尿外科常见疾病,以肾小管间质纤维化为主要病理特点。儿童梗阻性肾病最终可导致终末期肾脏疾病(end-stage renal disease ESRD),梗阻性肾病占所有ESRD的0.3％,占所有儿童肾移植的16.1％。在人类梗阻性肾病中,多数为不全性梗阻。
骨髓间充质干细胞(MSCs)具有自我增殖和多向分化潜能的特点,可向中胚层、内胚层和神经外胚层来源的组织细胞分化,包括成骨细胞、心肌细胞、神经细胞和肾脏细胞等,有研究表明骨髓MSCs在急性肾脏损伤小鼠模型中可以促进肾脏结构修复、改善肾功能。肝细胞生长因子(HGF)是促进成体干细胞向肾脏细胞分化的候选因子,还具有阻止肾小管细胞发生凋亡的能力。
本实验通过体外分离、培养、纯化和扩增大鼠骨髓MSCs,并建立单侧输尿管不全梗阻(partial unilateral ureter obstruction PUUO)大鼠动物模型,将Ad-HGF和MSCs共同移植入解除梗阻的PUUO大鼠体内,观察MSCs是否能够迁移、分布、定居到肾脏,并分化为相应的肾脏细胞,以及.Ad-HGF对MSCs的影响,为梗阻性肾病的基因治疗及细胞替代治疗提供一定的理论基础。
材料与方法:
MSCs细胞培养与纯化:体外分离、培养雄性SD大鼠MSCs,流式细胞仪进行CD34、CD90表型鉴定;以不同强度携带绿色荧光蛋白的重组腺病毒(Ad-GFP)转染MSCs,用流式细胞仪测定转染效率,筛选出最佳转染强度(MOI),并以最佳转染强度将Ad-GFP基因体外转染MSCs。
PUUO大鼠模型制作:成年健康雌性SD大鼠(260g±20g)(30只),按照对左肾输尿管上段处置方式不同随机分成5组,正常对照组(6只);腰大肌包埋组(6只);套管压迫组(6只);丝线结扎组(6只);浸液体石蜡油的丝线结扎组(6只)。分别于梗阻后3d、1W、2W各取2只,大体观察同时行IVP检查,确定输尿管梗阻情况。
MSCs细胞的转染及分化:选择成年健康雌性SD大鼠(260g±20g)32只,制作PUUO大鼠动物模型,随机分为对照组(A)和实验(B、C)。PUUO术后7天解除梗阻,并同时在解除梗阻侧肾脏实质多点注射,A组单纯注射生理盐水:B组注射绿色荧光蛋白标记的MSCs:C组注射MSCs与Ad-HGF的混合物。于注射术后7天、14天分别处死移植组及对照组大鼠,取双侧肾脏,制作石蜡切片,利用免疫荧光双标方法检测MSCs在PUUO大鼠肾脏中的分布及分化情况。
结果:
1、骨髓MSCs原代培养7-9天可传代,传代后细胞增殖加快,4-5天可再次传代;流式细胞仪鉴定结果显示骨髓MSCs中CD90阳性细胞占99％,不表达CD34。
2、转染强度MOI=400时,转染效率可达85.91％。
3、浸石蜡油的丝线结扎组模型用弹簧秤控制力度(0.25kg),使模型的均一性得到控制;用IVP检查确定模型组为输尿管不完全梗阻。
4、免疫荧光双标结果表明:在PUUO大鼠解除输尿管梗阻术后7天、14天梗阻侧肾脏均可见Ad-GFP阳性细胞,Ad-HGF和MSCs共同移植组与单纯MSCs移植组相比,Ad-GFP阳性细胞百分率明显增高,差异有统计学意义。
结论:
1、贴壁细胞分离法可以分离、纯化大鼠MSCs。
2、弹簧秤控制结扎力度(0.25 kg)下,浸石蜡油的丝线输尿管结扎法是一种理想的PUUO基础动物模型。
3、在PUUO大鼠模型中,在肾脏实质注射MSCs可以达到局部存活和分化为肾脏细胞,并且,HGF有促进存活和分化的可能。