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利用外源蛋白表达系统生产具有重要价值的药用蛋白是现代生物技术的核心内容和研究热点,也是各国政府和制药企业竞相巨额资助的研究领域之一。目前用于重组药用蛋白生产的表达系统主要有原核表达系统、酵母表达系统、昆虫表达系统、哺乳动物表达系统和植物表达系统。其中,酵母表达系统兼有原核和高等真核系统的优点。酵母是一种单细胞低等真核生物,培养条件普通,生长繁殖速度快,用于表达基因工程产品时,可以大规模生产,有效降低生产成本。酵母表达外源基因具有一定的翻译后加工能力,收获的外源蛋白质具有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰,性质较原核表达的蛋白质更加稳定,特别适合于表达真核生物基因和制备有功能的表达蛋白质。酵母表达系统又分为酿酒酵母表达系统和毕赤酵母表达系统,然而相比较而言,毕赤酵母由于有较强的启动子AOX、蛋白表达量高和表达分泌型目的蛋白,在近二十年来,得到了强烈的关注。生产后常用的纯化方法是固定化金属离子亲和层析(Immobilized Metal Affinity Chromatography,IMAC)。然而该方法纯化的蛋白,尤其对疫苗这样的药用蛋白来说,纯度往往不能达到要求,因此,还需要许多复杂的提纯方法及手段进一步纯化如GC-MS、LC-MS、CE-MS、SFC-MS、LC-NMR、CE-NMR、LC-FTIR等。因此,大批量生产高纯度的重组蛋白耗时耗力。考虑到在利用IMAC纯化重组蛋白时,影响到重组蛋白纯度的主要杂蛋白来源于宿主细胞,针对这一问题,有的学者提出通过阻断上游污染源,即利用IMAC获得影响重组蛋白纯度的蛋白,鉴定,敲除或是修饰该蛋白基因,从根源上减少污染源,从而减少了后续分离纯化步骤,同时降低生产成本的方法。 本文以毕赤酵母GS115作为研究对象,鉴定出该宿主中影响重组蛋白纯度的杂蛋白,为简化纯化步骤,消除蛋白污染源的构想进行了初步探索。所获得的研究结果如下: 首先,对超声波破碎的功率、超声时间、间歇时间、全程时间和细胞浓度进行调整,获得的最优的超声波破碎条件:细胞浓度265mg/ml,破碎条件功率400W,超声时间10s,间隔时间20s,全程时间30min。该条件能破碎产生228.94μg/ml的蛋白。 其次,通过生长曲线的测定,选用24h(对数生长期)、48h(稳定前期)和72h(稳定后期)这三个培养时间培养的酵母。进行镍柱纯化,可以发现不同时间培养下的酵母总的蛋白表达情况不同,随着培养时间的增加,蛋白表达总量增多,杂蛋白表达总量增加,但是24h、48h和72h培养的酵母总蛋白中杂蛋白分别为20.50％、18.56%和15.98%,以24h最高。并且杂蛋白表达量和表达种类不一致——不同浓度的咪唑洗脱液洗脱同一时间培养的酵母获得杂蛋白不一样,同一浓度咪唑洗脱液洗脱不同时间培养的酵母获得的杂蛋白也存在差异。在100mM咪唑下洗脱获得的蛋白条带以48h最多。 最后,对不同培养时间下的酵母利用100mM咪唑洗脱液洗脱下的蛋白进行2-DE和质谱鉴定,发现有相同的杂蛋白——乙醇脱氢酶(Alcoholdehydrogenase,ADH),且表达量都很高。通过对该蛋白的氨基酸序列分析,发现有5.43%氨基酸有与镍柱亲和结合的特性,通过同源建模,获得的三维结构图在PyMOL软件分析得出蛋白三维结构图表面存在与镍柱亲和结合的氨基酸,为该蛋白作为杂蛋白与镍柱结合提供了可能。 上述结果为今后在利用镍柱分离纯化重组蛋白的过程中,如何选择合适的培养时间和恰当的咪唑洗脱浓度提供了很好依据,也是对进一步构建酵母工程菌,简化目的蛋白纯化步骤,获得高纯度目的蛋白进行了初步的探索。