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目的:
通过对SPF级小鼠进行超数排卵和对SPF级KM小鼠胚胎进行玻璃化冷冻的研究,寻求SPF级小鼠的最佳超排方案和胚胎冷冻程序,以期获得一种高效、稳定而又简单易行的SPF级小鼠胚胎保存方法,为建立疾病动物模型种质资源库提供理论和实践依据。
方法:
1.选用4～10周龄SPF级BALB/c小鼠KM小鼠在春夏秋冬季进行超数排卵,4～8周龄定为常用周龄组,9～10周龄定为不常用周龄组,从见栓率、排卵率、3.5d平均胚胎获得数、胚胎类型等方面观察SPF级小鼠的超排效果。
2.分别以M2和DPBS液作为基础液配制玻璃化冷冻液,对SPF级KM小鼠的2-细胞胚、8-细胞胚和桑椹胚采用两步玻璃化冷冻法进行冷冻保存,冻存一周后复苏,从胚胎回收率、存活率和发育率三方面来观察胚胎冻存后的体外发育能力。
3.用不同的冷冻载体(0.25mL塑料细管和细胞冻存管)两步玻璃化冷冻法(平衡10min)冷冻保存SPF级KM小鼠的8-细胞胚和桑椹胚,冻存一周后复苏,观察胚胎冻存后的体外发育能力。
结果:
1.SPF级小鼠超数排卵效果(1)见栓率:①品系内见栓率比较SPF级BALB/c小鼠和KM小鼠春、夏、秋、冬季见栓率都无显著差异(P＞0.05):4～8周龄组和9～10周龄组之间的见栓率也差异不显著(P＞0.05)。②品系之间见栓率比较SPF级BALB/c小鼠和KM小鼠两种品系之间在春、夏、秋、冬季见栓率差异不显著,品系之间各周龄组见栓率差异也不具有统计学意义(P＞0.05)。(2)排卵率:①品系内排卵率比较SPF级BALB/c小鼠同一周龄组的排卵率在春、夏、秋、冬季之间差异不显著(P＞0.05),但春、夏、秋季之间具有周龄上的差异,9～10周龄组的平均排卵率要显著或极显著高于4～8周龄组(P＜0.05或P＜0.01);而冬季,9～10周龄组与4～8周龄组之间排卵率差异不显著(P＞0.05)。SPF级KM小鼠同一周龄组的排卵率在春、夏、秋季差异不显著(P＞0.05),但冬季排卵率远小于春、夏、秋三季,具有极显著差异(P＜0.01);春、夏、秋、冬季,SPF级KM小鼠9～10周龄组与4～8周龄组之间差异均不显著(P＞0.05)。②品系之间排卵率比较SPF级BALB/c小鼠和KM小鼠品系之间排卵率在季节和周龄上差异都不显著(P＞0.05)。(3)3.5d平均胚胎获得数:①品系内3.5d平均胚胎获得数比较SPF级BALB/c小鼠春、夏、秋季9～10周龄组3.5d平均胚胎获得数远大于4～8周龄组,差异极显著(P＜0.01),冬季则差异不显著(P＞0.05)。而SPF级KM小鼠春、夏、秋、冬四季,9～10周龄组与4～8周龄组的3.5d平均胚胎获得数差异不显著(P＞0.05)。②品系之间3.5d平均胚胎获得数比较经超排处理的SPF级KM小鼠获得的3.5d平均胚胎获得数远比BALB/c小鼠的多,差异极显著(P＜0.01)。(4)胚胎类型:SPF级BALB/c小鼠桑椹胚数远大于囊胚数,差异极显著(P＜0.01);SPF级KM小鼠桑椹胚与囊胚个数差异不显著(P＞0.05)。
2.SPF级KM小鼠胚胎冷冻保存效果:(1)采用M2和DPBS液作为冷冻保护剂的基础液,对SPF级KM小鼠各期胚冷冻保存,胚胎回收率、存活率和发育率两者之间没有显著性差异(P＞0.05)。而2-细胞胚与8-细胞胚和桑椹胚相比,存活率极显著降低(P＜0.01),发育率也极显著降低(P＜0.01);8-细胞胚和桑椹胚之间差异则不具有统计学意义(P＞0.05)。(2)KM小鼠各期胚胎在0.9mol/L EG中平衡5min或10min或15min,不同的平衡时间对胚胎回收率均无影响(P＞0.05),但对存活率和发育率有一定影响(P＜0.05),10min平衡时间较5min和15min好,差异具有统计学意义(P＜0.05),而5min与15min平衡时间无显著差异(P＞0.05)。(3)不同的冷冻载体(0.25mL塑料细管和细胞冻存管)对SPF级KM小鼠8-细胞胚和桑椹胚玻璃化冷冻,冻存后胚胎体外发育差异不显著(P＞0.05)。
结论:
SPF级小鼠超排效果受基因型的影响,KM小鼠4～10周龄均可进行超排,而BALB/c小鼠应选择较大周龄(9～10周)进行超排;超排宜在春夏秋季进行。采用细管两步玻璃化冷冻法可很好地保存SPF级KM小鼠8-细胞胚和桑椹胚;细胞冻存管也适用于小鼠胚胎冷冻保存,而且更方便实用。