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神经病理性疼痛指周围或中枢神经系统原发或继发性损害或功能障碍引起的疼痛,是一种常见并且严重影响人类健康的疾病。外周神经损伤常常会引起神经病理性疼痛,主要表现为痛超敏,即痛阈下降；痛觉过敏,即痛反应增强和自发性疼痛。由于具体机制还不清楚,目前对神经病理性疼痛的预防和治疗措施有限,因此加强在该领域的研究具有十分重要的意义。
大量的研究表明,神经损伤引起的脊髓背角神经元突触传递的可塑性变化,即中枢敏感化在病理性疼痛的产生与维持中起重要作用。1995年,刘先国等首次报导了脊髓背角C纤维诱发电位长时程增强(long-term potntiation,LTP)现象。众所周知,C纤维的主要功能是传导痛觉,并与脊髓背角神经元形成突触联系；而LTP是指突触传递效率长时间的增强,被认为是学习与记忆的突触机制。因此,脊髓背角C纤维诱发电位的LTP(即初级传入C纤维与脊髓背角神经元之间突触传递效率的持续性增强)被认为是一种痛记忆,是中枢敏感化的细胞模型。
脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)是神经营养因子家族的主要成员之一,具有很强的刺激和促进神经细胞生长分化、维持神经细胞存活和正常功能的作用。最近的研究发现BDNF可诱导脊髓C纤维诱发电位LTP的产生,在脊髓背角突触的传递和可塑性过程中起重要作用。同时它也在神经病理性疼痛的发生和发展过程中发挥重要作用,如:在多种神经损伤模型中,损伤同侧的脊髓背角BDNF mRNA及其蛋白表达上调。在正常动物鞘内注射BDNF能够诱导痛觉过敏的产生。运用抗-BDNF抗血清或鞘内注射TrkB-Fc(一种BDNF清道夫)阻断BDNF的作用后能够减轻大鼠的神经病理性疼痛症状。
同样,越来越多的研究证实脊髓的小胶质细胞在脊髓背角C纤维诱发电位的LTP和神经病理性疼痛的发病机制中也起重要的作用。小胶质细胞活化是HFS诱导LTP的重要条件。神经病理性疼痛的模型中,神经损伤可引起脊髓背角小胶质细胞的激活；鞘内注射小胶质细胞抑制剂美满霉素抑制小胶质细胞的功能可预防痛觉过敏现象。脊髓背角激活的小胶质细胞通过产生和释放致炎细胞因子和神经营养因子(如BDNF)来参与痛觉过敏的形成。
BDNF和小胶质细胞都在脊髓背角C纤维诱发电位的LTP和病理性疼痛的产生中发挥重要作用,激活的小胶质细胞可通过产生和释放BDNF来参与痛觉过敏的形成,但反过来BDNF是否也会影响小胶质细胞的功能,以及小胶质细胞在BDNF介导的脊髓背角C纤维诱发电位LTP和痛觉过敏形成过程中起什么作用等问题仍不清楚。
同时,已有报导,神经损伤后脊髓背角p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase；p38MAPK)和Src-家族激酶(Src-family kinases,SFKs)也在病理性疼痛的产生过程中起重要作用。外周神经损伤导致脊髓背角p38MAPK和SFKs的激活和痛觉过敏,鞘内给予p38MAPK或SFKs抑制剂能预防和/或减轻痛觉过敏。二者的激活仅见于小胶质细胞并且抑制二者中任一激酶的活化均能减轻痛觉过敏,但二者是否参与了BDNF介导的脊髓背角C纤维诱发电位LTP和痛觉过敏的形成以及其活化与小胶质细胞激活的关系也有待进一步研究。
因此,在本研究拟通过电生理,免疫组化和行为学方法研究:1.小胶质细胞在BDNF介导的脊髓C纤维诱发电位LTP中的作用；2.在病理性疼痛模型上验证小胶质细胞在BDNF介导的痛觉过敏中的作用；3.观察p38MAPK和SFKs的活化与小胶质细胞激活的关系；4.观察BDNF通过哪种受体作用于小胶质细胞。
第一章 BDNF通过激活脊髓背角小胶质细胞诱导脊髓C纤维诱发电位LTP
以往研究显示,在正常成年大鼠脊髓表面给予rhBDNF能够诱导脊髓背角C-纤维诱发场电位的晚期LTP。在这个研究中,我们将观察小胶质细胞是否参与脊髓BDNF诱导的脊髓C纤维诱发电位LTP,并观察p38MAPK和SFKs的活化与小胶质细胞激活的关系。
我们发现:(1)脊髓表面给予1ng/ml BDNF可诱导脊髓C纤维诱发电位LTP,免疫组化发现随着LTP的产生,小胶质细胞被逐步激活；(2)利用小胶质细胞选择性抑制剂美满霉素能抑制BDNF诱导的脊髓C纤维诱发电位LTP。(3)BDNF诱导脊髓C纤维诱发电位LTP后,p38 MAPK和SFKs也被激活且只见于小胶质细胞中。(4)脊髓表面给予SFKs的抑制剂PP2和SU6656都能抑制BDNF诱导的脊髓C纤维诱发电位LTP,并抑制小胶质细胞的激活,而其PP2的异构体PP3却无此作用。(5)脊髓表面给予p38MAPK抑制剂SB203580能抑制BDNF诱导的脊髓C纤维诱发电位LTP,并抑制小胶质细胞的激活。这些结果表明,外源性BDNF参与激活小胶质细胞并通过激活小胶质细胞诱导脊髓背角C-纤维诱发电位的LTP。而且小胶质细胞内p38 MAPK和SFKs的激活在小胶质细胞的激活过程中起重要作用。
第二章 BDNF通过激活脊髓背角小胶质细胞介导神经病理性疼痛
最近的研究表明,BDNF是一种脊髓伤害感受反应的内源性调质,主要通过与全长TrkB受体结合起作用参与病理性疼痛的形成。同时脊髓的小胶质细胞在神经病理性疼痛的发病机制中也起重要的作用。上一部分研究已显示,BDNF通过激活脊髓背角小胶质细胞诱导脊髓C纤维诱发电位LTP,导致中枢敏感化。为了进一步观察病理性疼痛的动物模型中BDNF是否也参与激活小胶质细胞,及其与p38 MAPK和SFKs的关系,我们应用免疫组化和行为学测试方法观察鞘内注射TrkB-Fc(一种BDNF清道夫)对病理性疼痛模型SNI大鼠的影响。我们发现:(1)SNI大鼠产生机械性痛觉过敏后,手术同侧脊髓背角BDNF和TrkB表达上调,且脊髓背角的小胶质细胞上既表达BDNF也表达TrkB受体。(2)SNI造模前1h开始,鞘内注射TrkB-Fc,每天一次,连续8天,能够减轻大鼠手术同侧后爪的机械性痛觉过敏。(3)通过免疫组化方法发现鞘内注射TrkB-Fc能抑制脊髓背角BDNF和TrkB的表达。(4)免疫荧光双染显示脊髓背角BDNF和TrkB均表达于神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞。(5)鞘内注射TrkB-Fc能抑制脊髓背角小胶质细胞的表达。(6)鞘内注射TrkB-Fc还能抑制脊髓背角p38MAPK和SFKs两种激酶的活化,提示小胶质细胞内这两种激酶的活化与BDNF的过表达有关。(4)免疫荧光双染显示,p—SFK和p—P38MAPK只表达于小胶质细胞而不表达于神经元和星形胶质细胞。说明BDNF通过激活小胶质细胞及其中p38 MAPK和SFKs两种激酶引起机械痛觉过敏,并且BDNF通过TrkB受体激活小胶质细胞。
结语：
1.外源性BDNF参与激活小胶质细胞并通过激活小胶质细胞诱导脊髓背角C-纤维诱发场电位的LTP。
2.内源性BDNF通过激活小胶质细胞及其中的p38 MAPK和SFKs两种激酶引起机械痛觉过敏。
3.小胶质细胞内的p38 MAPK和SFKs的激活在小胶质细胞的激活过程中起重要作用。
4.BDNF通过TrkB受体激活小胶质细胞。