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帕金森病(Parkinsons disease，PD)是一种在老年人群中常见的，以震颤、肌强直、运动迟缓为主要临床症状的神经退行性疾病，其发病机理并不十分清楚，可能与特发性黑质致密部多巴胺能神经元变性，多巴胺(dopamine，DA)含量减少，导致纹状体内乙酰胆碱递质系统功能亢进有关。以往关于PD病人尸检的研究结果只能反映疾病终末期相对固定的情况，并不能满足研究疾病早期病理改变或动态观察多巴胺能神经元退变的需要，从而限制了对该疾病的研究。MPTP帕金森病动物模型是公认的研究帕金森病的经典动物模型，但以往研究大多选用急性或亚急性模型，不能进行长期观察，也不利于研究渐进的发展过程，也没有发现神经元内包涵体的形成。因此建立合适的动物模型是研究PD发病机制、病理变化及治疗措施的关键。 帕金森病以形成α-synuclein为主要成分的路易小体(LBs)为主要病理特征，对α-synuclein蛋白表达、变异、聚集、降解等方面的研究成为国内外近年来研究热点。已有的研究表明，α-synuclein异常聚集和降解障碍在帕金森病发病中起关键作用，但具体机制还不清楚。正常情况下，可溶性α-synuclein蛋白主要通过泛素-蛋白酶体系统(UPS)和分子伴侣介导的自噬(CAM)进行降解，但是突变或过表达的致病性α-synuclein在体内易于聚集，这些聚集物或低聚体不能进入蛋白酶体狭窄的圆柱状通道，而主要依赖于自噬-溶酶体途径(ALP)进行降解。目前国内外对α-synuclein蛋白自噬溶酶体途径的研究主要是在细胞、转基因模型或急性、亚急性动物模型基础上进行，而基于慢性MPTP小鼠PD模型的α-synuclein介导细胞自噬信号通路的研究国内外尚未见报道。本课题主要从α-synuclein自噬溶酶体途径蛋白降解障碍角度研究α-synuclein的慢性致病形式及其在PD中的毒性机制，对进一步探讨PD发病机制具有重要意义。 神经退行性病变过程的研究发现，中枢神经系统内蛋白质之间存在异常的相互作用。β-synuclein是α-synuclein的同源蛋白，与α-synuclein联系紧密，两种同源蛋白的比例失衡检测已成为神经退行性病变的重要生理指标。在表达人β-synuclein、α-synuclein的双转基因小鼠的研究中发现，β-synuclein减轻了人α-synuclein转基因小鼠运动缺陷、神经退行性病变和神经元内α-synuclein聚集现象，推测β-synuclein可能是α-synuclein引起的神经退行性病变的负向调节因子，可抑制α-synuclein聚集，对神经元起到保护作用。因此，α-synuclein和β-synuclein之间也具有重要的相互交叉作用，与帕金森病有着密切的关系，但具体作用机制尚不清楚，基于MPTP慢性PD小鼠模型的α-synuclein与β-synuclein的表达及相互关系的研究在国内外尚未见报道。 本课题首先选用慢性小鼠模型作为研究对象，采用MPTP长期间歇性给药方式，模拟渐进性发病过程，通过小鼠行为学观察和中脑黑质致密部神经元变性死亡检测，神经元内α-synuclein表达，评估构建的慢性帕金森病小鼠模型;随后检测神经元自噬水平变化，从而研究MPTP作用于小鼠后，过表达α-synuclein对自噬信号通路的影响，探讨自噬-溶酶体途径在α-synuclein降解过程中的作用及其分子机制;最后观察α-synuclein、β-synuclein蛋白降解程度及RT-PCR检测基因水平表达的差异，讨论MPTP慢性PD模型小鼠中脑黑质α-synuclein发生聚集的病理过程和揭示α-synuclein与β-synuclein两者之间相互作用关系，为下一步β-synuclein蛋白治疗打下基础。本课题分为以下三个部分: 第一部分 MPTP慢性帕金森病小鼠模型构建、神经行为学观察和细胞损伤死亡的分析 目的: 成功构建MPTP慢性帕金森病小鼠模型 方法: 本课题构建MPTP腹腔注射的雄性C57BL/6J小鼠作为慢性PD动物模型，注射方式为20mg/kg/次，隔日一次，共15次。分为生理盐水对照组(Saline)和药物组(MPTP)。各组在注射药物前、注射药物10天、1月、停药后1月、3月共5个时间点观察行为学（包括一般情况、自主活动、悬尾实验以及步态分析等）的改变;停药后1月和3月时，每组小鼠取脑组织制作冰冻切片，用免疫组织化学方法检测中脑黑质部位酪氨酸羟化酶(TH)、尼氏小体(Nissl)、神经元核抗原(NeuN)的表达，了解细胞的损伤程度;免疫荧光观察α-synuclein表达;评估构建的MPTP慢性PD小鼠模型。 结果: (1)行为学观察 1.急性损伤表现:MPTP腹腔注射后15分钟至1小时，表现出竖毛、竖尾，全身震颤等症状，24小时后症状逐渐恢复; 2.药物组小鼠在注射MPTP(10d，1m，2m，3m)后出现体重下降，与对照组小鼠比较没有显著差异; 3.步态分析:药物组右侧前后肢步长较对照组小鼠显著减小，步态不稳; 4.自主活动:药物组水平移动距离和直立次数较对照组小鼠有显著减少，但这些指标在打药后2月和3月时出现一定程度的恢复; 5.悬尾实验:药物组小鼠的挣扎次数和翻转次数较对照组出现了明显的减少。 (2)中脑黑质部位细胞损伤死亡分析 1.TH检测:MPTP药物注射后1月和药物注射后3月，免疫组化TH染色显示药物组1月、药物组3月TH阳性细胞数明显减少; 2.Nissl染色:药物组1月和3月较对照组神经元阳性细胞计数明显减少; 3.NeuN检测:免疫荧光检测成熟神经元NeuN结果阳性细胞计数药物组1月和3月较对照组显著减少。 (3)中脑黑质部位α-synuclein表达分析 100倍油镜观察药物组1月、3月中脑黑质部位α-synuclein神经元胞浆内红色免疫荧光增强，弥漫性浓度增加，呈团块状或浓染聚集在胞核外，3月较1月药物组聚集更加明显，有包涵体形成。而对照组α-synuclein在胞浆内均匀弥漫性分布，染色浅、无聚集现象。 小结: 上述行为学检测、细胞损伤死亡分析和α-synuclein表达结果表明，MPTP慢性PD小鼠模型小鼠出现运动功能障碍和中脑黑质部位神经元细胞损伤死亡，神经元胞浆内出现α-synuclein聚集，包涵体形成从而印证了构建的MPTP慢性PD小鼠模型是成功的。 第二部分α-synuclein介导细胞自噬信号通路的研究 目的:在成功构建的MPTP慢性PD小鼠模型基础上，探讨自噬-溶酶体途径在α-synuclein降解过程中的作用及其分子机制。 方法: 停药后1月、3月小鼠取脑组织制作冰冻切片，首先免疫荧光双标染色观察MPTP作用对小鼠黑质致密部α-synuclein蛋白与其他自噬相关蛋白表达的关系，检测指标为α-synuclein/LC3、α-synuclein/CathepsinD、α-Synuclein/ATP13A2和α-synuclein/LAMP-2(C-20);随后采用Western blot分析MPTP作用小鼠黑质致密部自噬相关蛋白表达，分析自噬信号传导通路途径，检测指标为LC3、Beclin1、mTOR、p-p70s6K;最后透射电镜检测神经元超微结构的病理改变。 结果: 1.中脑黑质部位α-synuclein蛋白与自噬相关蛋白表达的关系:MPTP1月和3月药物组神经元胞浆内α-synuclein和检测的其他蛋白表达都增多，免疫荧光增强，出现α-synuclein颗粒样或团块样聚集，包涵体形成，3月药物组更加明显。α-synuclein与自噬蛋白LC3、溶酶体酶Cathepsin D、溶酶体膜蛋白LAMP-2、ATP13A2免疫荧光双标部分图像融合，在胞浆内存在共定位现象，说明α-synuclein聚集在溶酶体内。随观察时间延长，药物组3月神经元胞浆内点状团状聚集增多更显著。 2.中脑部位自噬相关蛋白的表达:western blot显示MPTP1月药物组与1月对照组相比，LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白的表达水平均下降，但区别不显著;3月药物组出现LC3-Ⅰ、 LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白的表达水平明显下降，有显著区别。自噬抑制因子mTOR蛋白及其下游效应器磷酸化p70S6k蛋白的表达量在药物组1月出现稍有升高，无统计学意义，但药物组3月出现显著升高。 3.电镜超微观结构观察:药物组1月出现线粒体肿胀、嵴变短、高尔基复合体排列紊乱、断裂等细胞损伤改变;3月药物组核膜断裂、自噬小泡、自噬溶酶体形成增多。 小结: MPTP作用于小鼠后，突触核蛋白自噬小体增多，蛋白降解和自噬能力减弱，α-synuclein在胞浆内聚集，揭示聚集的α-synuclein是通过自噬溶酶体途径进行降解的，推测由于自噬功能障碍导致细胞退化死亡这一发病机制的。MPTP对神经元细胞的毒性作用与观察时间具有相关性，在停药后3月MPTP对神经毒性作用仍持续存在，有累积效应。 第三部分 MPTP慢性PD模型中仅-synuclein与β-synuclein的表达及相互关系研究 目的: 研究MPTP慢性PD模型小鼠中脑黑质α-synuclein与β-synuclein的表达及两者之间相互作用关系。 方法: MPTP慢性PD模型小鼠，取中脑黑质致密部冰冻切片，用免疫荧光染色激光共聚焦观察α-synuclein与β-synuclein蛋白表达的变化和定位关系;提取中脑蛋白用Western blot方法检测α-synuclein与β-synuclein蛋白表达改变;最后，采用实时荧光定量PCR检测中脑α-synuclein与β-synuclein在mRNA基因水平表达的差异。 结果: 1.中脑黑质α-synuclein与β-synuclein免疫荧光的表达:药物组较对照组比较，胞浆内α-synuclein表达明显增多，免疫荧光增强，出现α-synuclein聚集，呈颗粒样或团块样，包涵体形成，3月组较1月组更加明显;药物组1月、3月同对照组比较，β-synuclein染色阳性神经元细胞计数明显减少。α-synuclein/β-synuclein免疫荧光双标染色图像融合后显示部分染色阳性神经元可融合; 2.中脑黑质部位脑组织蛋白行western blot表达:药物组1月和3月小鼠α-synuclein蛋白表达水平均较对照组显著增加，而β-synuclein则出现明显减少趋势; 3.中脑黑质区域脑组织mRNA表达水平检测:1月和3月药物组α-synmRNA较对照组稍有增加，但无统计学意义;1月和3月药物组β-synmRNA表达较对照组稍有下降，但也无统计学意义。 小结: MPTP慢性PD小鼠模型中脑黑质药物组α-Synuclein蛋白表达增多，聚集，包涵体形成，β-synuclein蛋白表达减少。实时荧光定量PCR检测mRNA相对水平显示，MPTP并没有对α-synuclein、β-synuclein产生转录激活作用。 结论: 1.成功构建了MPTP慢性PD动物模型。 2.MPTP慢性PD小鼠中脑黑质神经元内聚集的α-synuclein通过自噬溶酶体途径进行降解，并出现自噬功能障碍，导致细胞退化死亡这一发病机制。 3.MPTP并没有对MPTP慢性PD小鼠中脑黑质神经元α-synuclein、β-synuclein产生转录激活作用。