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为了获得高产优质的甘蔗原生质体细胞，为获得甘蔗原生质体再生植株打下基础，本研究以新台糖22号ROC22和桂糖28号GT28幼叶为材料，研究了甘蔗原生质体分离的影响因素、原生质体培养程序及相关的技术环节，对ROC22和GT28甘蔗原生质体的分离、纯化和培养条件进行优化，研究结果表明: 1.酶解前质壁分离0.5 h与质壁分离0h相比:GT28和ROC22原生质体的产量和活力分别增加了65.62％、2.08％和105.94％、1.84％; 2.在酶液组合0.5％果胶酶+2％纤维素酶+0.3％半纤维素酶+0.1％离析酶下，ROC22原生质体的产量和活力最高，分别为:2.55×107个·g-1和98.54％; GT28原生质体的产量和活力最高，分别为:2.05×107个·g-1和99.83％; 3.不同酶解时间对原生质体产量影响差异显著，在酶解10h时，ROC22和GT28原生质体的产量分别比酶解5h时增加了35.4％和89.81％，酶解10h最适合甘蔗原生质体的分离; 4.甘蔗原生质体纯化最适合的离心速率是800 rpm，GT28和ROC22原生质体的产量达到最高，分别为2.1×107个·g-1和2.02×107个·g-1，比500 rpm时相比，分别增加了70.73％和82.23％;当离心速率增加到1200 rpm时，ROC22和GT28原生质体的活力分别下降10.13％和11.12％; 5.甘蔗原生质体培养最适合培养基是KM8P，在KM8P培养基中，ROC22原生质体的分裂频率比MS和N6培养基中分别增加了6.14％和13.17％，而植板率分别增加5.21％和8.91％; GT28的原生质体在KM8P培养基中其分裂频率比在MS和N6培养基中分别增加了9.84％和18.1％，植板率分别增加了8.56％和10.26％。 6.最适合两品种原生质体培养的2，4-D浓度是3 mg·L-1，在此浓度下，GT28原生质体再生细胞的分裂频率和植板率分别高达19.24％和14.18％，与不加2，4-D时相比其分裂频率和植板率分别增加了6.88％和5.74％，ROC22原生质体在2，4-D浓度为3mg·L-1时，原生质体的分裂频率和植板率高达19.31％和13.95％与不加2，4-D时相比其分裂频率和植板率分别增加了8.07％和7.31％; 7.微滴培养时，GT28原生质体的分裂频率和植板率达到最高，分别比固液培养增加了8.89％和5.36％，分别比液体培养时增加了13.58％和6.52％; ROC22原生质体的分裂频率和植板率比固液培养时分别增加了5.27％和7.07％，比液体培养时分别增加了10.5％和7.81％; 8.在激素组合1 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1 KT下，甘蔗原生质体的分裂频率最高，GT28为20.77％，ROC22为18.88％;加入分化培养基培养21 d后，GT28和ROC22原生质体再生细胞的长度，比激素组合1 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1 NAA下分别增加了9.57μm和10.57μm，与激素组合2 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA相比，则分别增加了11.98μm和17.38μm; GT28和ROC22再生细胞的宽度分别变为12.59μm和14.38μm，此时细胞变为长条状，面积也分别增大到473.59μm2和564.33μm2。 综上，在酶解前质壁分离0.5 h，并在0.5％果胶酶+2％纤维素酶+0.3％半纤维素酶+0.1％离析酶组合酶下，酶解10h，通过800 rpm的离心速率下，获得的甘蔗原生质体的产量和活力最高，在KM8P培养基中，以微滴方式进行培养，同时附加3 mg·L-12，4-D时，最适合原生质体的培养，以上研究结果为原生质体融合育种过程中获得优质原生质体细胞提供了技术支撑，为甘蔗体细胞融合育种的成功打下了前期基础，同时也为植物单细胞分离和培养提供了科学依据。