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肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率居癌症死亡的首位，据世界卫生组织统计，每年约有176万人死于肺癌。由于绝大多数的肺癌患者在临床确诊时多属进展期或难以治愈的Ⅲb期或Ⅳ期，因此失去了手术根治的机会。而近些年来，随着免疫治疗在临床上的逐渐应用，其显示出了一定的优势，并对部分肺癌患者的预后产生了改善，因此被推荐为晚期肺癌标准治疗方案之一。其中肿瘤特异性T细胞是目前具有良好发展前景的免疫细胞，因此发掘能被T淋巴细胞识别的靶抗原是治疗的关键。
癌睾丸抗原(cancer testis antigen，CTA)家族是目前已知的肺癌组织中重要的肿瘤相关抗原。癌睾丸抗原家族的表达模式具有相当程度的特异性：该蛋白家族内的成员在多种癌症中均有表达，如肺癌、乳腺癌、黑色素瘤，对于正常组织而言，癌睾丸抗原仅在睾丸细胞中表达，偶尔也可以在胎盘组织中被检测到，且睾丸拥有免疫豁免能力，不会被免疫系统识别并杀伤。因此，癌睾丸抗原家族是肿瘤免疫治疗的理想标靶。
黑色素瘤抗原基因(melanoma antigen gene, MAGE)属于CTA亚家族，是一种肿瘤相关性抗原，其具有免疫原性及表达限制性。据研究显示，人类的MAGE家族基因位于X染色体上，其编码的肿瘤排斥抗原(tumor rejection antigen;TRA)，经过细胞内的加工从而产生抗原肽，并与人类白细胞抗原(human leukocyte antigen ，HLA)结合形成复合物，被自体细胞毒性T淋巴细胞特异性识别，能诱导对肿瘤细胞具有特异性杀伤能力的细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)。MAGE家族的表达模式和CTA家族相同，在多种肿瘤细胞中均有表达，如乳腺癌、黑色素瘤、食管癌、结直肠癌，且在大多数正常组织中不表达。本研究认为，MAGE家族有极大的潜力作为CTL介导肿瘤特异性免疫治疗的预备标靶。对于MAGE家族的深入研究和理解有助于肺癌的分子生物学诊断和个体化分子靶向治疗。
树突状细胞(dendritie cells，DC)是非单核吞噬细胞中的一种，是人体内已知的功能最强的抗原呈递细胞(Antigen-presenting cells, APC)，抗肿瘤免疫的产生依赖于DC细胞对肿瘤抗原的捕获与加工处理，随后将抗原信息呈递给淋巴组织内的未成熟T细胞并激活机体的特异性抗肿瘤免疫反应。具有肿瘤特异性的细胞毒T细胞(cytotoxic T lymphocyte ,CTL)具有杀伤能力强、增殖活性强等特点。本研究拟通过MAGE-A10抗原肽与DC细胞共同培养并诱导肿瘤特异性CTL细胞，以有效杀伤癌细胞株。有学者使用与MAGE家族基因序列相似的共同表位肽进行了类似研究，证明了这个短肽对于肿瘤细胞的诱导杀伤能力。
抗肿瘤免疫治疗不仅受限于肿瘤细胞表面免疫原性强弱还受到肿瘤特异性抗原的表达量和表达率的限制。靶抗原在肿瘤细胞表面表达是以肽为基础免疫治疗的核心，提升靶抗原的表达量在一定程度上可改善肿瘤免疫治疗的效果。5-氮-2-脱氧胞苷(5-aza-2-deoxycytidine or DAC)是一种特异性的甲基化抑制剂，可以降低甲基化水平，应用该药物可以使MAGE-A10表达量升高。因此，本研究采用DAC处理肺癌细胞株，以期望能诱导MAGE-A10的表达升高。
目前在肺癌中，高表达的MAGE-A10与患者临床病理学参数及患者生存之间的关系尚无定论。且将MAGE-A10抗原肽及去甲基药物DAC免疫疗法用于肺癌的免疫治疗的研究尚未见报道。
因此，本课题设计MAGE-A10抗原肽联合去甲基药物DAC肺癌的体外杀伤作用进行研究。通过免疫组织化学法检测肺癌组织中MAGE-A10在蛋白水平的表达情况，探讨MAGE-A10的表达与患者临床病理特征的关系，通过Kaplan-MeierPlotter在线公共数据库进行生存分析，验证MAGE-A10对肺癌患者预后的影响，在不同的肺癌原代细胞及细胞系中验证去甲基药物DAC是否可以诱导肺癌细胞表面MAGE-A10表达的增加，在去甲基化药物处理过的肺癌细胞系中验证MAGE-A10特异性CTL对去甲基化药物诱导的肺癌细胞的杀伤效果。
第一部分MAGE-A10抗原在人肺癌组织的表达及临床意义
目的：采用免疫组织化学法，研究MAGE-A10抗原在肺癌患者组织中的表达及其与临床病理参数的相关性，为MAGE-A10抗原肽参与肿瘤免疫治疗建立理论基础。
方法：
1.免疫组织化学法检测MAGE-A10抗原在正常肺组织中和肺癌组织中的表达。
2.分析MAGE-A10抗原表达与患者临床病理参数的相关性。
3.采用Kaplan-Meier生存分析法，分析肺癌患者MAGE-A10抗原阳性表达与患者5年总生存率情况。
结果：1.免疫组织化学检测结果显示，MAGE-A10蛋白在正常肺组织中阳性表达率低，阳性表达4例，阴性表达26例，阳性表达率为13.3%，在肺癌组织中阳性表达率高，阳性表达198例，阴性表达218例，阳性表达率为47.6%，在肺癌细胞质和细胞核均有表达。2.统计结果显示，MAGE-A10蛋白的表达与肺癌患者的年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤临床分期、没有相关性，(P＞0.05)，与淋巴结转移(6.81，0.0090)、复发转移(4.64，0.0313)具有相关性(P＜0.05)。3.MAGE-A10分子阳性表达的肺癌患者较阴性表达患者5年总生存率更低。LogRank检验结果P=5.002e-10。
结论：
MAGE-A10抗原在肺癌组织呈阳性表达，正常肺组织少有表达，提示MAGE-A10抗原可以作为肺癌免疫治疗的靶抗原。MAGE-A10可能与肺癌患者的不良预后相关。
第二部分MAGE-A10抗原在人肺癌细胞系和原代细胞的表达及MAGE-A10的生物信息学分析
目的：研究MAGE-A10在人肺癌细胞系及原代细胞中的表达状况；使用生物信息学方法分析MAGE-A10表达与患者生存的关系。
方法：
1.通过qRT-PCR和Westernblot技术检测人类肺癌细胞系A549和H1975及原代细胞L228、L419及L329细胞中MAGE-A10的表达。
2.从Kaplan-MeierPlotter在线公共数据库(http://www.kmplot.com)获得1926例OS样本，344例FP样本，982例PPS样本，并进行生存分析。
结果：1.在肺癌细胞系中，A549细胞中的MAGE-A10mRNA呈低水平表达，而在H1975细胞中呈高水平表达；在肺癌原代细胞中，L329细胞中的MAGE-A10mRNA呈低水平表达，而在L228及L419细胞中呈高水平表达。2.基于开放的公共数据库Kaplan-MeierPlotter的分析结果显示，高表达MAGE-A10的肺癌患者其总生存期、进展后生存期及首次进展时间均短于MAGE-A10低表达的患者(P＜0.05)。
结论：
1.H1975、L228及L419细胞中MAGE-A10mRNA呈高水平表达，A549细胞及L329细胞呈低表达水平。
2.MAGE-A10高表达的肺癌患者其总生存期、进展后生存期及首次进展时间均短于MAGE-A10低表达的患者。
第三部分去甲基化药物对MAGE-A10特异性CTL杀伤活性及对肺癌细胞杀伤效应影响的研究
目的：研究去甲基化药物DAC对MAGE-A10特异性CTL杀伤活性及对肺癌细胞杀伤效应影响。
方法：
1.通过qRT-PCR和Westernblot技术检测去甲基化药物DAC处理后肺癌细胞H1975、L228、L419、A549及L329细胞中MAGE-A10mRNA和蛋白的表达。
2.ELISA法检测MAGE-A10共同抗原特异性CTL与肺癌组织原代细胞混合培养上清中IFN-γ分泌水平。
3.细胞毒性实验检测MAGE-A10特异性CTL对肺癌组织原代细胞杀伤效应的影响。
结果：1.去甲基化药物DAC可诱导H1975细胞、L228细胞及L419细胞MAGE-A10表达量增加，且MAGE-A10蛋白表达量和mRNA量呈剂量依赖性。2.IFN-γ释放实验结果显示同时加入MAGE-A10抗原肽与DAC组IFN-γ分泌水平有显著升高，且效靶比越高，IFN-γ分泌水平越高(P＜0.05)。3.细胞毒性实验结果显示，在同一效靶比下MAGE-A10抗原肽+DAC组杀伤效率最高。效靶比为40:1时杀伤效率最高。
结论：
1.去甲基化药物DAC可诱导H1975细胞、L228细胞及L419细胞MAGE-A10表达量增加。
2.去甲基化药物DAC能够增强MAGE-A10共同抗原肽特异性CTL对H1975细胞、L228细胞及L419细胞的杀伤功能。
癌睾丸抗原(cancer testis antigen，CTA)家族是目前已知的肺癌组织中重要的肿瘤相关抗原。癌睾丸抗原家族的表达模式具有相当程度的特异性：该蛋白家族内的成员在多种癌症中均有表达，如肺癌、乳腺癌、黑色素瘤，对于正常组织而言，癌睾丸抗原仅在睾丸细胞中表达，偶尔也可以在胎盘组织中被检测到，且睾丸拥有免疫豁免能力，不会被免疫系统识别并杀伤。因此，癌睾丸抗原家族是肿瘤免疫治疗的理想标靶。
黑色素瘤抗原基因(melanoma antigen gene, MAGE)属于CTA亚家族，是一种肿瘤相关性抗原，其具有免疫原性及表达限制性。据研究显示，人类的MAGE家族基因位于X染色体上，其编码的肿瘤排斥抗原(tumor rejection antigen;TRA)，经过细胞内的加工从而产生抗原肽，并与人类白细胞抗原(human leukocyte antigen ，HLA)结合形成复合物，被自体细胞毒性T淋巴细胞特异性识别，能诱导对肿瘤细胞具有特异性杀伤能力的细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)。MAGE家族的表达模式和CTA家族相同，在多种肿瘤细胞中均有表达，如乳腺癌、黑色素瘤、食管癌、结直肠癌，且在大多数正常组织中不表达。本研究认为，MAGE家族有极大的潜力作为CTL介导肿瘤特异性免疫治疗的预备标靶。对于MAGE家族的深入研究和理解有助于肺癌的分子生物学诊断和个体化分子靶向治疗。
树突状细胞(dendritie cells，DC)是非单核吞噬细胞中的一种，是人体内已知的功能最强的抗原呈递细胞(Antigen-presenting cells, APC)，抗肿瘤免疫的产生依赖于DC细胞对肿瘤抗原的捕获与加工处理，随后将抗原信息呈递给淋巴组织内的未成熟T细胞并激活机体的特异性抗肿瘤免疫反应。具有肿瘤特异性的细胞毒T细胞(cytotoxic T lymphocyte ,CTL)具有杀伤能力强、增殖活性强等特点。本研究拟通过MAGE-A10抗原肽与DC细胞共同培养并诱导肿瘤特异性CTL细胞，以有效杀伤癌细胞株。有学者使用与MAGE家族基因序列相似的共同表位肽进行了类似研究，证明了这个短肽对于肿瘤细胞的诱导杀伤能力。
抗肿瘤免疫治疗不仅受限于肿瘤细胞表面免疫原性强弱还受到肿瘤特异性抗原的表达量和表达率的限制。靶抗原在肿瘤细胞表面表达是以肽为基础免疫治疗的核心，提升靶抗原的表达量在一定程度上可改善肿瘤免疫治疗的效果。5-氮-2-脱氧胞苷(5-aza-2-deoxycytidine or DAC)是一种特异性的甲基化抑制剂，可以降低甲基化水平，应用该药物可以使MAGE-A10表达量升高。因此，本研究采用DAC处理肺癌细胞株，以期望能诱导MAGE-A10的表达升高。
目前在肺癌中，高表达的MAGE-A10与患者临床病理学参数及患者生存之间的关系尚无定论。且将MAGE-A10抗原肽及去甲基药物DAC免疫疗法用于肺癌的免疫治疗的研究尚未见报道。
因此，本课题设计MAGE-A10抗原肽联合去甲基药物DAC肺癌的体外杀伤作用进行研究。通过免疫组织化学法检测肺癌组织中MAGE-A10在蛋白水平的表达情况，探讨MAGE-A10的表达与患者临床病理特征的关系，通过Kaplan-MeierPlotter在线公共数据库进行生存分析，验证MAGE-A10对肺癌患者预后的影响，在不同的肺癌原代细胞及细胞系中验证去甲基药物DAC是否可以诱导肺癌细胞表面MAGE-A10表达的增加，在去甲基化药物处理过的肺癌细胞系中验证MAGE-A10特异性CTL对去甲基化药物诱导的肺癌细胞的杀伤效果。
第一部分MAGE-A10抗原在人肺癌组织的表达及临床意义
目的：采用免疫组织化学法，研究MAGE-A10抗原在肺癌患者组织中的表达及其与临床病理参数的相关性，为MAGE-A10抗原肽参与肿瘤免疫治疗建立理论基础。
方法：
1.免疫组织化学法检测MAGE-A10抗原在正常肺组织中和肺癌组织中的表达。
2.分析MAGE-A10抗原表达与患者临床病理参数的相关性。
3.采用Kaplan-Meier生存分析法，分析肺癌患者MAGE-A10抗原阳性表达与患者5年总生存率情况。
结果：1.免疫组织化学检测结果显示，MAGE-A10蛋白在正常肺组织中阳性表达率低，阳性表达4例，阴性表达26例，阳性表达率为13.3%，在肺癌组织中阳性表达率高，阳性表达198例，阴性表达218例，阳性表达率为47.6%，在肺癌细胞质和细胞核均有表达。2.统计结果显示，MAGE-A10蛋白的表达与肺癌患者的年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤临床分期、没有相关性，(P＞0.05)，与淋巴结转移(6.81，0.0090)、复发转移(4.64，0.0313)具有相关性(P＜0.05)。3.MAGE-A10分子阳性表达的肺癌患者较阴性表达患者5年总生存率更低。LogRank检验结果P=5.002e-10。
结论：
MAGE-A10抗原在肺癌组织呈阳性表达，正常肺组织少有表达，提示MAGE-A10抗原可以作为肺癌免疫治疗的靶抗原。MAGE-A10可能与肺癌患者的不良预后相关。
第二部分MAGE-A10抗原在人肺癌细胞系和原代细胞的表达及MAGE-A10的生物信息学分析
目的：研究MAGE-A10在人肺癌细胞系及原代细胞中的表达状况；使用生物信息学方法分析MAGE-A10表达与患者生存的关系。
方法：
1.通过qRT-PCR和Westernblot技术检测人类肺癌细胞系A549和H1975及原代细胞L228、L419及L329细胞中MAGE-A10的表达。
2.从Kaplan-MeierPlotter在线公共数据库(http://www.kmplot.com)获得1926例OS样本，344例FP样本，982例PPS样本，并进行生存分析。
结果：1.在肺癌细胞系中，A549细胞中的MAGE-A10mRNA呈低水平表达，而在H1975细胞中呈高水平表达；在肺癌原代细胞中，L329细胞中的MAGE-A10mRNA呈低水平表达，而在L228及L419细胞中呈高水平表达。2.基于开放的公共数据库Kaplan-MeierPlotter的分析结果显示，高表达MAGE-A10的肺癌患者其总生存期、进展后生存期及首次进展时间均短于MAGE-A10低表达的患者(P＜0.05)。
结论：
1.H1975、L228及L419细胞中MAGE-A10mRNA呈高水平表达，A549细胞及L329细胞呈低表达水平。
2.MAGE-A10高表达的肺癌患者其总生存期、进展后生存期及首次进展时间均短于MAGE-A10低表达的患者。
第三部分去甲基化药物对MAGE-A10特异性CTL杀伤活性及对肺癌细胞杀伤效应影响的研究
目的：研究去甲基化药物DAC对MAGE-A10特异性CTL杀伤活性及对肺癌细胞杀伤效应影响。
方法：
1.通过qRT-PCR和Westernblot技术检测去甲基化药物DAC处理后肺癌细胞H1975、L228、L419、A549及L329细胞中MAGE-A10mRNA和蛋白的表达。
2.ELISA法检测MAGE-A10共同抗原特异性CTL与肺癌组织原代细胞混合培养上清中IFN-γ分泌水平。
3.细胞毒性实验检测MAGE-A10特异性CTL对肺癌组织原代细胞杀伤效应的影响。
结果：1.去甲基化药物DAC可诱导H1975细胞、L228细胞及L419细胞MAGE-A10表达量增加，且MAGE-A10蛋白表达量和mRNA量呈剂量依赖性。2.IFN-γ释放实验结果显示同时加入MAGE-A10抗原肽与DAC组IFN-γ分泌水平有显著升高，且效靶比越高，IFN-γ分泌水平越高(P＜0.05)。3.细胞毒性实验结果显示，在同一效靶比下MAGE-A10抗原肽+DAC组杀伤效率最高。效靶比为40:1时杀伤效率最高。
结论：
1.去甲基化药物DAC可诱导H1975细胞、L228细胞及L419细胞MAGE-A10表达量增加。
2.去甲基化药物DAC能够增强MAGE-A10共同抗原肽特异性CTL对H1975细胞、L228细胞及L419细胞的杀伤功能。