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胰腺癌是恶性肿瘤中死亡率最高的一种癌症，发病率呈逐年升高的趋势。因其早期诊断困难，大部分患者确诊时已发展到癌症晚期，且现有治疗手段效果欠佳。寻找胰腺癌早期诊断的生物标志物以及针对胰腺癌开发靶向药物具有十分重要的意义。肿瘤蛋白D52(tumor protein D52, TPD52)基因家族是近年来被发现的一类原癌基因，与多种实体肿瘤的发生发展相关。然而，目前关于TPD52在肿瘤发生发展中更加深入的研究数量相对较少，在胰腺癌中可能的作用机制也不明确。本研究首先在组织水平研究胰腺癌组织中TPD52表达与患者临床生物学行为的关系；然后在细胞水平研究TPD52对胰腺癌细胞生物学行为(如细胞增殖、迁移和侵袭)的影响及其机制；最后通过建立裸鼠皮下移植瘤模型，观察TPD52对裸鼠皮下移植瘤生长的影响，以期为胰腺癌病情的综合评估和分子靶向治疗提供依据。
第一部分胰腺癌组织中TPD52表达与患者临床生物学行为关系的研究
目的：本研究通过检测TPD52在胰腺癌组织中的表达情况，分析TPD52与患者临床生物学行为的相关性，探讨TPD52在胰腺癌诊治中的临床价值。
方法：
1.收集自2014年1月至2018年10月河北省沧州市中心医院收治的、经病理确诊且有完整随访资料的115例胰腺导管腺癌患者石蜡包埋组织标本。
2.应用免疫组织化学技术检测配对的胰腺癌组织和癌旁正常胰腺组织中TPD52蛋白的表达水平。
3.采用卡方检验或Fisher确切概率法分析胰腺癌组织中TPD52的表达与患者临床病理特征的关系。
4.采用Kaplan-Meier法、Cox风险回归模型分析胰腺癌组织中TPD52的表达与患者预后的关系。
结果：
1．TPD52主要在细胞胞浆及细胞膜中表达，胰腺导管腺癌组织中TPD52呈不同程度的阳性表达，阳性表达率85.22%(98/115)。
2．胰腺癌组织中TPD52的表达水平与患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤原发病灶情况、区域淋巴结转移情况、肝转移及门静脉侵犯无关(P＞0.05)。
3．根据病理组织分化程度分为高分化组、中分化组、低分化组，TPD52阳性表达率分别是33.30%、70.50%、72.20%，三组间TPD52阳性表达率的差异有统计学意义(x2=9.593，P＜0.05)。
4．肿瘤神经浸润组与无肿瘤神经浸润组TPD52阳性表达率分别是74.00%、50.00%，两组间TPD52阳性表达率的差异有统计学意义(x2=6.754，P＜0.05)。
5．根据病理TNM分期分为Ⅰ期组、Ⅱ期组、Ⅲ期组、Ⅳ期组，TPD52阳性表达率分别是42.90%、71.00%、75.00%、80.00%，四组间TPD52阳性表达率的差异有统计学意义(x2=7.829,P＜0.05)。
6．TPD52阳性表达组患者mOS为21个月，TPD52阴性表达组患者mOS为31个月，两组之间mOS的差异有统计学意义(x2=9.986，P＜0.05)。区域淋巴结转移、肝转移和TPD52表达情况被认定为影响OS的独立危险因素(P＜0.05)，对OS的相关危险度分别是2.517、12.467和2.070。
小结：
1．胰腺导管腺癌组织中TPD52表达水平与患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤原发病灶情况、区域淋巴结转移情况、肝转移及门静脉侵犯无关。
2．TPD52的表达水平与胰腺癌组织分化程度、肿瘤神经浸润及病理TNM分期有关。
3．TPD52阳性表达组患者mOS显著低于TPD52阴性表达组。区域淋巴结转移、肝转移和TPD52表达情况是影响胰腺癌患者OS的独立危险因素。
4．TPD52有可能成为判断胰腺癌患者生物学行为和预后的特异性生物学标志物。
第二部分抑制TPD52基因表达对胰腺癌细胞生物学行为的影响
目的：观察抑制TPD52基因表达对胰腺癌细胞生物学行为的影响。
方法：
1.构建shRNA重组质粒，转染胰腺癌细胞，筛选稳定转染细胞株。按实验计划分组：亲本组、对照组、转染组。
2.RT-PCR及Westernblot检测TPD52-shRNA转染对胰腺癌细胞TPD52mRNA水平及蛋白表达的影响。
3.CCK-8实验检测TPD52-shRNA转染对胰腺癌细胞体外增殖的影响，并利用流式细胞术检测对细胞周期的影响。
4.Hoechst染色及流式细胞术检测TPD52-shRNA转染对胰腺癌细胞凋亡的影响，并利用Westernblot检测对凋亡相关蛋白表达水平的影响。
5.细胞划痕试验检测TPD52-shRNA转染对胰腺癌细胞体外迁移的影响。
6.Transwell小室侵袭实验检测TPD52-shRNA转染对胰腺癌细胞体外侵袭的影响。
结果：
1.RT-PCR检测结果显示转染组细胞中TPD52的mRNA表达水平较亲本组及对照组显著降低(P＜0.001)；Westernblot检测结果显示转染组TPD52蛋白表达量显著低于亲本组及对照组中的表达量(P＜0.001)。
2.CCK-8实验检测细胞增殖结果显示在第24h、第48h和第72h时转染组OD值较对照组显著降低，具有统计学差异(P＜0.05)。流式细胞术检测细胞周期结果显示转染组G0/G1期细胞较对照组明显增加(P＜0.05)，S期细胞明显减少(P＜0.01)。
3.Hoechst染色检测细胞凋亡结果显示转染组较对照组凋亡阳性细胞明显增加(P＜0.001)。流式细胞术检测细胞凋亡结果显示转染组凋亡细胞较对照组明显增加(P＜0.001)。Westernblot检测凋亡相关蛋白结果显示转染组较对照组cleavedcaspase-3和Bax蛋白表达量显著增加(P＜0.001)，Bcl-2显著减少(P＜0.001)。
4.细胞划痕实验检测细胞迁移结果显示转染组较对照组细胞迁移能力减弱，24h迁移率显著降低(P＜0.05)。
5.Transwell小室检测细胞侵袭结果显示转染组较对照组细胞侵袭能力显著降低，跨膜细胞个数明显减少(P＜0.05)。
小结：
1．抑制TPD52表达可明显抑制胰腺癌细胞增殖，导致细胞周期阻滞在G0/G1期，并可促进其凋亡。
2．抑制TPD52表达可抑制胰腺癌细胞迁移及侵袭能力。
3．抑制TPD52表达可以调控胰腺癌细胞生物学行为。
第三部分TPD52调控胰腺癌细胞生物学行为的机制研究
目的：以shRNA抑制TPD52基因表达及Akt激活剂处理细胞为研究手段，探讨TPD52调控胰腺癌细胞生物学行为的机制。
方法：
1．按实验计划分组：NC＋DMSO组、shTPD52＋DMSO组、shTPD52＋SC79组。
2．CCK-8实验和Hoechst染色检测Akt激活剂对TPD52-shRNA转染抑制胰腺癌细胞增殖及促进凋亡的影响。
3．细胞划痕实验和Transwell小室侵袭实验检测Akt激活剂对TPD52-shRNA转染抑制胰腺癌细胞迁移及侵袭的影响。
4．Westernblot检测添加Akt激活剂同时抑制TPD52表达对胰腺癌细胞Akt和p-Akt蛋白水平的影响。
结果：
1.CCK-8实验检测细胞增殖结果显示shTPD52＋DMSO组较NC＋DMSO组、shTPD52＋SC79组在第24h、第48h和第72h时吸光度值(OD值)显著降低，具有统计学差异(P＜0.05)。
2.Hoechst染色检测细胞凋亡结果显示shTPD52＋DMSO组较NC＋DMSO组凋亡细胞明显增加，shTPD52＋SC79组较shTPD52＋DMSO组凋亡细胞明显减少(P＜0.001)。
3.细胞划痕实验检测细胞迁移结果显示shTPD52＋DMSO组较NC＋DMSO组细胞迁移能力减弱；shTPD52＋SC79组较shTPD52＋DMSO组细胞迁移能力增强，24h迁移率上升(P＜0.05)。
4.Transwell小室检测细胞侵袭结果显示shTPD52＋SC79组较shTPD52＋DMSO组细胞侵袭能力显著回升，跨膜细胞数量增加(P＜0.05)。
5.Westernblot检测结果显示与shTPD52＋DMSO组相比，shTPD52＋SC79组p-Akt蛋白水平显著升高(P＜0.01)。
小结：
1.抑制TPD52表达可抑制胰腺癌细胞增殖并促进凋亡，加入Akt激活剂可逆转其作用。
2.抑制TPD52表达可抑制胰腺癌细胞迁移及侵袭能力，加入Akt激活剂可逆转其抑制作用。
3.抑制TPD52表达可降低胰腺癌细胞p-Akt蛋白水平，Akt激活剂可逆转其作用。
4.TPD52可能通过Akt信号通路参与胰腺癌细胞生物学行为的调控。
第四部分抑制TPD52基因表达对胰腺癌细胞裸鼠皮下移植瘤的影响
目的：研究抑制TPD52基因表达对裸鼠皮下移植瘤增殖的影响。
方法：
1．将12只裸鼠随机分为2组，每组6只，接种AsPC-1-NC细胞者为对照组；接种AsPC-1-shTPD52细胞者为转染组。
2．建立胰腺癌AsPC-1细胞裸鼠皮下移植瘤模型，观察移植瘤的生长情况。
3．病理切片HE染色观察裸鼠皮下移植瘤组织形态学。
4．Westernblot检测裸鼠皮下移植瘤细胞中TPD52、Akt及p-Akt蛋白水平。
结果：
1.转染组裸鼠皮下移植瘤成瘤较对照组明显较小，成瘤体积自7d起，差异具有显著性(P＜0.001)；转染组移植瘤平均重量低于对照组(P＜0.0001)。
2.转染组皮下移植瘤组织内出现坏死，细胞密度降低，有大量的纤维结缔组织增生；对照组皮下移植瘤组织细胞丰富，核分裂象多见，瘤组织中有丰富的血管。
3.Westernblot检测结果显示与对照组相比，转染组TPD52及p-Akt蛋白水平显著下调(P＜0.001)。
小结：
1.抑制胰腺癌细胞TPD52表达可使裸鼠皮下移植瘤生长受到明显抑制。
2.抑制胰腺癌细胞TPD52表达可使裸鼠皮下移植瘤细胞密度降低，纤维结缔组织增生。
3.抑制胰腺癌细胞TPD52表达可使移植瘤中TPD52蛋白表达水平降低，可能在体内通过Akt信号通路降低胰腺癌细胞增殖，抑制肿瘤生长。
结论：
1．胰腺癌组织中TPD52表达水平与胰腺癌组织分化程度、肿瘤神经浸润及病理TNM分期有关；TPD52表达水平是影响胰腺癌患者OS的独立危险因素。
2．抑制TPD52表达可明显抑制胰腺癌细胞增殖、迁移及侵袭能力，并促进细胞凋亡；Akt激活剂可逆转抑制TPD52表达对胰腺癌细胞生物学行为的影响。
3．抑制胰腺癌细胞TPD52表达能够显著抑制裸鼠皮下移植瘤的生长。
4．TPD52可能通过Akt信号通路调控胰腺癌生物学行为，可能成为判断胰腺癌临床生物学行为的特异性生物学标志物及胰腺癌基因治疗的新靶点。
第一部分胰腺癌组织中TPD52表达与患者临床生物学行为关系的研究
目的：本研究通过检测TPD52在胰腺癌组织中的表达情况，分析TPD52与患者临床生物学行为的相关性，探讨TPD52在胰腺癌诊治中的临床价值。
方法：
1.收集自2014年1月至2018年10月河北省沧州市中心医院收治的、经病理确诊且有完整随访资料的115例胰腺导管腺癌患者石蜡包埋组织标本。
2.应用免疫组织化学技术检测配对的胰腺癌组织和癌旁正常胰腺组织中TPD52蛋白的表达水平。
3.采用卡方检验或Fisher确切概率法分析胰腺癌组织中TPD52的表达与患者临床病理特征的关系。
4.采用Kaplan-Meier法、Cox风险回归模型分析胰腺癌组织中TPD52的表达与患者预后的关系。
结果：
1．TPD52主要在细胞胞浆及细胞膜中表达，胰腺导管腺癌组织中TPD52呈不同程度的阳性表达，阳性表达率85.22%(98/115)。
2．胰腺癌组织中TPD52的表达水平与患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤原发病灶情况、区域淋巴结转移情况、肝转移及门静脉侵犯无关(P＞0.05)。
3．根据病理组织分化程度分为高分化组、中分化组、低分化组，TPD52阳性表达率分别是33.30%、70.50%、72.20%，三组间TPD52阳性表达率的差异有统计学意义(x2=9.593，P＜0.05)。
4．肿瘤神经浸润组与无肿瘤神经浸润组TPD52阳性表达率分别是74.00%、50.00%，两组间TPD52阳性表达率的差异有统计学意义(x2=6.754，P＜0.05)。
5．根据病理TNM分期分为Ⅰ期组、Ⅱ期组、Ⅲ期组、Ⅳ期组，TPD52阳性表达率分别是42.90%、71.00%、75.00%、80.00%，四组间TPD52阳性表达率的差异有统计学意义(x2=7.829,P＜0.05)。
6．TPD52阳性表达组患者mOS为21个月，TPD52阴性表达组患者mOS为31个月，两组之间mOS的差异有统计学意义(x2=9.986，P＜0.05)。区域淋巴结转移、肝转移和TPD52表达情况被认定为影响OS的独立危险因素(P＜0.05)，对OS的相关危险度分别是2.517、12.467和2.070。
小结：
1．胰腺导管腺癌组织中TPD52表达水平与患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤原发病灶情况、区域淋巴结转移情况、肝转移及门静脉侵犯无关。
2．TPD52的表达水平与胰腺癌组织分化程度、肿瘤神经浸润及病理TNM分期有关。
3．TPD52阳性表达组患者mOS显著低于TPD52阴性表达组。区域淋巴结转移、肝转移和TPD52表达情况是影响胰腺癌患者OS的独立危险因素。
4．TPD52有可能成为判断胰腺癌患者生物学行为和预后的特异性生物学标志物。
第二部分抑制TPD52基因表达对胰腺癌细胞生物学行为的影响
目的：观察抑制TPD52基因表达对胰腺癌细胞生物学行为的影响。
方法：
1.构建shRNA重组质粒，转染胰腺癌细胞，筛选稳定转染细胞株。按实验计划分组：亲本组、对照组、转染组。
2.RT-PCR及Westernblot检测TPD52-shRNA转染对胰腺癌细胞TPD52mRNA水平及蛋白表达的影响。
3.CCK-8实验检测TPD52-shRNA转染对胰腺癌细胞体外增殖的影响，并利用流式细胞术检测对细胞周期的影响。
4.Hoechst染色及流式细胞术检测TPD52-shRNA转染对胰腺癌细胞凋亡的影响，并利用Westernblot检测对凋亡相关蛋白表达水平的影响。
5.细胞划痕试验检测TPD52-shRNA转染对胰腺癌细胞体外迁移的影响。
6.Transwell小室侵袭实验检测TPD52-shRNA转染对胰腺癌细胞体外侵袭的影响。
结果：
1.RT-PCR检测结果显示转染组细胞中TPD52的mRNA表达水平较亲本组及对照组显著降低(P＜0.001)；Westernblot检测结果显示转染组TPD52蛋白表达量显著低于亲本组及对照组中的表达量(P＜0.001)。
2.CCK-8实验检测细胞增殖结果显示在第24h、第48h和第72h时转染组OD值较对照组显著降低，具有统计学差异(P＜0.05)。流式细胞术检测细胞周期结果显示转染组G0/G1期细胞较对照组明显增加(P＜0.05)，S期细胞明显减少(P＜0.01)。
3.Hoechst染色检测细胞凋亡结果显示转染组较对照组凋亡阳性细胞明显增加(P＜0.001)。流式细胞术检测细胞凋亡结果显示转染组凋亡细胞较对照组明显增加(P＜0.001)。Westernblot检测凋亡相关蛋白结果显示转染组较对照组cleavedcaspase-3和Bax蛋白表达量显著增加(P＜0.001)，Bcl-2显著减少(P＜0.001)。
4.细胞划痕实验检测细胞迁移结果显示转染组较对照组细胞迁移能力减弱，24h迁移率显著降低(P＜0.05)。
5.Transwell小室检测细胞侵袭结果显示转染组较对照组细胞侵袭能力显著降低，跨膜细胞个数明显减少(P＜0.05)。
小结：
1．抑制TPD52表达可明显抑制胰腺癌细胞增殖，导致细胞周期阻滞在G0/G1期，并可促进其凋亡。
2．抑制TPD52表达可抑制胰腺癌细胞迁移及侵袭能力。
3．抑制TPD52表达可以调控胰腺癌细胞生物学行为。
第三部分TPD52调控胰腺癌细胞生物学行为的机制研究
目的：以shRNA抑制TPD52基因表达及Akt激活剂处理细胞为研究手段，探讨TPD52调控胰腺癌细胞生物学行为的机制。
方法：
1．按实验计划分组：NC＋DMSO组、shTPD52＋DMSO组、shTPD52＋SC79组。
2．CCK-8实验和Hoechst染色检测Akt激活剂对TPD52-shRNA转染抑制胰腺癌细胞增殖及促进凋亡的影响。
3．细胞划痕实验和Transwell小室侵袭实验检测Akt激活剂对TPD52-shRNA转染抑制胰腺癌细胞迁移及侵袭的影响。
4．Westernblot检测添加Akt激活剂同时抑制TPD52表达对胰腺癌细胞Akt和p-Akt蛋白水平的影响。
结果：
1.CCK-8实验检测细胞增殖结果显示shTPD52＋DMSO组较NC＋DMSO组、shTPD52＋SC79组在第24h、第48h和第72h时吸光度值(OD值)显著降低，具有统计学差异(P＜0.05)。
2.Hoechst染色检测细胞凋亡结果显示shTPD52＋DMSO组较NC＋DMSO组凋亡细胞明显增加，shTPD52＋SC79组较shTPD52＋DMSO组凋亡细胞明显减少(P＜0.001)。
3.细胞划痕实验检测细胞迁移结果显示shTPD52＋DMSO组较NC＋DMSO组细胞迁移能力减弱；shTPD52＋SC79组较shTPD52＋DMSO组细胞迁移能力增强，24h迁移率上升(P＜0.05)。
4.Transwell小室检测细胞侵袭结果显示shTPD52＋SC79组较shTPD52＋DMSO组细胞侵袭能力显著回升，跨膜细胞数量增加(P＜0.05)。
5.Westernblot检测结果显示与shTPD52＋DMSO组相比，shTPD52＋SC79组p-Akt蛋白水平显著升高(P＜0.01)。
小结：
1.抑制TPD52表达可抑制胰腺癌细胞增殖并促进凋亡，加入Akt激活剂可逆转其作用。
2.抑制TPD52表达可抑制胰腺癌细胞迁移及侵袭能力，加入Akt激活剂可逆转其抑制作用。
3.抑制TPD52表达可降低胰腺癌细胞p-Akt蛋白水平，Akt激活剂可逆转其作用。
4.TPD52可能通过Akt信号通路参与胰腺癌细胞生物学行为的调控。
第四部分抑制TPD52基因表达对胰腺癌细胞裸鼠皮下移植瘤的影响
目的：研究抑制TPD52基因表达对裸鼠皮下移植瘤增殖的影响。
方法：
1．将12只裸鼠随机分为2组，每组6只，接种AsPC-1-NC细胞者为对照组；接种AsPC-1-shTPD52细胞者为转染组。
2．建立胰腺癌AsPC-1细胞裸鼠皮下移植瘤模型，观察移植瘤的生长情况。
3．病理切片HE染色观察裸鼠皮下移植瘤组织形态学。
4．Westernblot检测裸鼠皮下移植瘤细胞中TPD52、Akt及p-Akt蛋白水平。
结果：
1.转染组裸鼠皮下移植瘤成瘤较对照组明显较小，成瘤体积自7d起，差异具有显著性(P＜0.001)；转染组移植瘤平均重量低于对照组(P＜0.0001)。
2.转染组皮下移植瘤组织内出现坏死，细胞密度降低，有大量的纤维结缔组织增生；对照组皮下移植瘤组织细胞丰富，核分裂象多见，瘤组织中有丰富的血管。
3.Westernblot检测结果显示与对照组相比，转染组TPD52及p-Akt蛋白水平显著下调(P＜0.001)。
小结：
1.抑制胰腺癌细胞TPD52表达可使裸鼠皮下移植瘤生长受到明显抑制。
2.抑制胰腺癌细胞TPD52表达可使裸鼠皮下移植瘤细胞密度降低，纤维结缔组织增生。
3.抑制胰腺癌细胞TPD52表达可使移植瘤中TPD52蛋白表达水平降低，可能在体内通过Akt信号通路降低胰腺癌细胞增殖，抑制肿瘤生长。
结论：
1．胰腺癌组织中TPD52表达水平与胰腺癌组织分化程度、肿瘤神经浸润及病理TNM分期有关；TPD52表达水平是影响胰腺癌患者OS的独立危险因素。
2．抑制TPD52表达可明显抑制胰腺癌细胞增殖、迁移及侵袭能力，并促进细胞凋亡；Akt激活剂可逆转抑制TPD52表达对胰腺癌细胞生物学行为的影响。
3．抑制胰腺癌细胞TPD52表达能够显著抑制裸鼠皮下移植瘤的生长。
4．TPD52可能通过Akt信号通路调控胰腺癌生物学行为，可能成为判断胰腺癌临床生物学行为的特异性生物学标志物及胰腺癌基因治疗的新靶点。