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研究背景：锌是生命有机体维持正常生命活动所必需的微量营养元素之一,它作为多种金属酶和蛋白的关键组分或辅助因子而广泛参与生命体中许多种重要的生物化学反应,在机体的生长、发育以及代谢过程中发挥重要作用。哺乳动物中,两大锌转运体基因家族参与锌在细胞内外的转运：ZIP和ZnT。ZIP家族蛋白能够通过增加对胞外的锌摄取或者促进细胞器内的锌释放至胞浆,而提高细胞浆内的锌含量；ZnT家族蛋白则是通过增加细胞质内的锌外流至胞外以及促进胞浆内的锌进入细胞器内区室化,而降低细胞浆内的锌含量。由于两大锌转运体基因家族在锌转运功能方面表现出相反的作用,因此锌转运体在维持细胞内外锌的平衡稳定起着至关重要作用。缺锌会引起生物体免疫功能低下,同时,缺锌对锌转运体的表达会产生重要影响。对小鼠锌转运体基因表达分析研究表明,在一些不成熟的免疫细胞中ZIP2活跃表达；幼儿过敏性哮喘患者血清锌明显低于正常水平,且外周血单个核细胞(PBMC)中ZIP2mRNA量显著高于正常水平。提示在免疫细胞中ZIP2可能发挥一定的作用。肺结核是由结核杆菌引起的慢性传染病,在机体抵抗力低下时患上肺结核的风险会增加。因此,探讨单核细胞中ZIP2过表达对其产生的影响以及研究ZIP2在肺结核患者中表达及其对免疫细胞因子表达产生的影响很有必要,为进一步研究ZIP2在免疫细胞功能方面的研究奠定基础。研究目的：将构建的ZIP2真核表达载体体外转染至人单核细胞系THP-1中,检测ZIP2过表达情况,并检测ZIP2过表达对THP-1细胞中其他锌转运体表达、干扰素γ(INF-γ)和白介素6(IL-6)mRNA水平、肿瘤坏死因子α(TNF-a)分泌以及细胞增殖能力的影响；对比肺结核患者及正常人PBMC中ZIP2表达情况,初步探讨肺结核中锌转运体表达改变情况,并利用siRNA技术干扰肺结核患者PBMC中ZIP2基因表达,检测ZIP2干扰对INF-γ和IL-6表达的影响。研究方法：分离正常人的PBMC, Trizol法提取总RNA,通过RT-PCR的方法获得ZIP2的cDNA后,将其定向克隆至pEGFP-N1真核表达载体。将构建完成的PEGFP-N1-ZIP2真核表达载体转染至人单核细胞系THP-1。转染48h后,Trizol法抽提转染细胞的总RNA, RT-PCR的方法检测其中ZIP2的过表达对锌转运体ZIP1、ZnT1、ZnT5、ZIP6、ZIP8、ZIP1O及INF-γ及IL-6mRNA水平产生的影响；采用双抗体夹心法ELISA测定转染后LPS激活时TNF-a的分泌情况；通过MTT实验检测ZIP2对细胞增殖的影响。临床收集23例肺结核患者以及42例正常人的抗凝外周血液样本并收取相关临床资料,同时收集血清并测定血清锌含量。分离抗凝血的PBMC, Trizol法提取其中总RNA,通过Real-time PCR的方法检测PBMC中ZIP2mRNA变化,同时利用RT-PCR方法检测分析其中ZnTl、ZIP6、ZIP1、ZnT5、ZIP10表达情况；利用电穿孔转染技术将siRNA片段转染至肺结核患者PBMC中,干扰ZIP2表达,并利用Real-time PCR检测细胞因子INF-γ及IL-6表达改变情况。结果：构建的PEGFP-N1-ZIP2真核表达载体转染至THP-1细胞后,结果表明THP-1细胞中ZIP2过表达,但ZIP2过表达对ZnTl、ZIP1、ZIP6、ZIP8、ZIP10、ZnT5mRNA量均没有显著影响(P>0.05)；ZIP2过表达使THP-1细胞INF-γ表达下调(P<0.05),而IL-6表达改变没有显著差异(P>0.05)。ZIP2过表达对THP-1细胞分泌的TNF-a和THP-1细胞的增殖能力均没有显著影响(P>0.05)。肺结核患者的血清锌含量明显低于正常对照组(P<0.05)；Real-time PCR结果显示肺结核患者PBMC中ZIP2的表达量明显高于正常对照组(P<0.003)。RT-PCR结果显示,肺结核患者中,ZnTl表达上调(P<0.00002)；ZIP6表达下调(P<1.5×10-9)；ZIP1、ZnT5表达改变没有显著差异(P>0.05)；ZIP1O表达下调(P<0.003)。利用电穿孔转染siRNA干扰片段干扰肺结核患者PBMC中ZIP2,Real-time PCR结果显示,ZIP2干扰效果明显,并且ZIP2干扰后肺结核患者PBMC中INF-γ表达下调(P<0.01)、IL-6表达上调(P<0.01)。结论：本实验构建了PEGFP-N1-ZIP2真核表达载体,并将其转染至THP-1细胞中。转染48h后,ZIP2过表达对THP-1细胞系中其他锌转运体表达、IL-6表达、细胞分泌TNF-α、细胞增殖能力没有显著影响,但能使INF-γ表达下调。肺结核患者PBMC中ZIP2表达明显上调,ZnTl表达明显上调,ZIP6、ZIP10表达明显下调,ZIPl、ZnT5表达没有显著改变；干扰肺结核患者PBMC中ZIP2表达后,INF-γ表达下调,IL-6表达上调。ZIP2对肺结核患者淋巴细胞的免疫活性有一定的作用。