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背景:近年来肾癌的全球发病率以每年2％-3％的速度持续增长，已经成为全球男性第六大常见癌症，也是中国城市地区第十大常见癌症。由于肾脏的位置隐匿，且临床上目前缺乏筛查肾癌早期患者的有效生物标志物，大约30％的患者在肿瘤进展期才被明确诊断，失去手术治愈的机会。因此，需要深入了解肾癌发生发展过程中分子调控机制，为临床应用提供敏感性和特异性理想的生物标志物用于肾癌早期诊断及协助临床决策。核仁小RNA(small nucleolar RNA)分布于真核细胞的核仁中，是一类中等大小的小分子非编码RNA，主要参与rRNA的成熟和转录后化学修饰调控。研究表明，snoRNAs与肿瘤的发生发展密切相关，并且在体液中不受RNase的降解，可以稳定表达并被检测，有作为肿瘤标志物的潜力。然而目前关于snoRNAs在肾癌发生发展中的作用及机制尚不明晰。因此本研究将验证血浆和尿沉渣snoRNAs作为肾癌新型标志物能力;并以SNORD4A为研究对象探索其在肾癌发生发展中的作用及分子调控机制。
方法:通过肾透明细胞癌组织TCGA数据，筛选出肾透明细胞癌组织与癌旁组织差异表达的snoRNAs，RT-PCR验证肾透明细胞癌患者石蜡组织、血浆、尿沉渣和健康志愿者之间snoRNAs分子表达差异情况。应用受试者操作特征(Receiver Operator Characteristic，ROC)曲线分析特异性和敏感性，并计算曲线下面积(Area Under Curve，AUC)用来评价诊断效能。进一步以SNORD4A作为研究对象，探索其对肾癌生物学行为的调控。通过RNAFISH实验及RT-PCR方法确定SNORD4A的亚细胞定位;细胞增殖实验，克隆形成实验，细胞凋亡实验等方法研究SNORD4A在体外对肾癌生物学行为的影响;裸鼠移植瘤实验研究SNORD4A在体内对肾癌生物学行为的影响。蛋白质谱筛用于筛选差异蛋白，westernblot验证所筛选的差异蛋白以及相关分子通路蛋白的表达。
结果:首先，根据TCGA数据库筛选出在肾透明细胞癌与健康志愿者之间差异表达的4种snoRNAs分子，包括:SNORD4A、SNORD63、SNORD96A、SNORD93。这四种snoRNAs在肾癌石蜡组织和尿沉渣中表达升高(P＜0.05);与健康志愿者相比，肾癌患者血浆SNORD96A表达明显升高(P＜0.0001)，而SNORD4A、SNORD63以及SNORD93无明显差异(P＞0.05)。尿沉渣SNORD4A、SNORD63、SNORD96A以及SNORD93可作为肾癌患者的标志物，此外，血浆SNORD96A对肾癌甚至是早期肾癌患者具有良好的诊断效能。
接下来，以SNORD4A为研究对象，探索其对肾癌生物学行为的调控能力。体外实验结果表明干扰SNORD4A表达后，肾癌细胞的增殖和克隆形成能力增强，凋亡能力减弱;过表达SNORD4A后，肾癌细胞的增殖和克隆形成能力减弱。动物实验结果显示，干扰SNORD4A的表达后裸鼠皮下移植瘤生长变慢。蛋白功能质谱分析显示，Wnt信号通路在SNORD4A对肾癌生物学行为的调控中起着重要作用。Westernblot结果显示，SNORD4A通过下游Dvl2蛋白发挥作用，且沉默或过表达SNORD4A引起Dvl2在mRNA表达水平的改变(P＜0.05)。在肾癌细胞中加入Wnt通路激活剂或抑制剂后，拯救了SNORD4A干扰或过表达对细胞增殖能力的影响，进一步表明SNORD4A通过Wnt信号通路发挥作用。
结论:SNORD4A、SNORD63、SNORD96A以及SNORD93在肾癌患者组织及尿沉渣中上调，且肾癌患者血浆中SNORD96A的表达水平显著高于健康志愿者;尿沉渣snoRNAs可作为肾癌新型诊断标志物且血浆SNORD96A对肾癌具有较好的诊断价值。此外，SNORD4A对肾癌恶性表型的具有调控作用，且SNORD4A通过Wnt信号通过调控肾癌恶性生物学行为。
方法:通过肾透明细胞癌组织TCGA数据，筛选出肾透明细胞癌组织与癌旁组织差异表达的snoRNAs，RT-PCR验证肾透明细胞癌患者石蜡组织、血浆、尿沉渣和健康志愿者之间snoRNAs分子表达差异情况。应用受试者操作特征(Receiver Operator Characteristic，ROC)曲线分析特异性和敏感性，并计算曲线下面积(Area Under Curve，AUC)用来评价诊断效能。进一步以SNORD4A作为研究对象，探索其对肾癌生物学行为的调控。通过RNAFISH实验及RT-PCR方法确定SNORD4A的亚细胞定位;细胞增殖实验，克隆形成实验，细胞凋亡实验等方法研究SNORD4A在体外对肾癌生物学行为的影响;裸鼠移植瘤实验研究SNORD4A在体内对肾癌生物学行为的影响。蛋白质谱筛用于筛选差异蛋白，westernblot验证所筛选的差异蛋白以及相关分子通路蛋白的表达。
结果:首先，根据TCGA数据库筛选出在肾透明细胞癌与健康志愿者之间差异表达的4种snoRNAs分子，包括:SNORD4A、SNORD63、SNORD96A、SNORD93。这四种snoRNAs在肾癌石蜡组织和尿沉渣中表达升高(P＜0.05);与健康志愿者相比，肾癌患者血浆SNORD96A表达明显升高(P＜0.0001)，而SNORD4A、SNORD63以及SNORD93无明显差异(P＞0.05)。尿沉渣SNORD4A、SNORD63、SNORD96A以及SNORD93可作为肾癌患者的标志物，此外，血浆SNORD96A对肾癌甚至是早期肾癌患者具有良好的诊断效能。
接下来，以SNORD4A为研究对象，探索其对肾癌生物学行为的调控能力。体外实验结果表明干扰SNORD4A表达后，肾癌细胞的增殖和克隆形成能力增强，凋亡能力减弱;过表达SNORD4A后，肾癌细胞的增殖和克隆形成能力减弱。动物实验结果显示，干扰SNORD4A的表达后裸鼠皮下移植瘤生长变慢。蛋白功能质谱分析显示，Wnt信号通路在SNORD4A对肾癌生物学行为的调控中起着重要作用。Westernblot结果显示，SNORD4A通过下游Dvl2蛋白发挥作用，且沉默或过表达SNORD4A引起Dvl2在mRNA表达水平的改变(P＜0.05)。在肾癌细胞中加入Wnt通路激活剂或抑制剂后，拯救了SNORD4A干扰或过表达对细胞增殖能力的影响，进一步表明SNORD4A通过Wnt信号通路发挥作用。
结论:SNORD4A、SNORD63、SNORD96A以及SNORD93在肾癌患者组织及尿沉渣中上调，且肾癌患者血浆中SNORD96A的表达水平显著高于健康志愿者;尿沉渣snoRNAs可作为肾癌新型诊断标志物且血浆SNORD96A对肾癌具有较好的诊断价值。此外，SNORD4A对肾癌恶性表型的具有调控作用，且SNORD4A通过Wnt信号通过调控肾癌恶性生物学行为。