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目的:观察低剂量T-2毒素对软骨细胞的影响,旨在研究关节软骨损伤的分子机制。
方法:选取1-2日龄Wistar乳鼠,酶消化法获得软骨细胞,体外培养24h后添加不同剂量的T-2毒素,采用胎盘蓝染色法进行细胞活力测定;单细胞凝胶电泳观察软骨细胞DNA损伤:免疫组化方法检测细胞分泌能力;倒置显微镜、透射电镜观察软骨细胞结构改变。
结果:①体外培养的原代软骨细胞形态:刚分离的软骨细胞为球形,24小时后细胞开始贴壁,逐渐伸展为三角或多角形,细胞核大而圆,细胞清亮透明,立体感强,贴壁的细胞借突起相互聚集成细胞团或细胞丛。
②细胞增殖:T-2毒素对软骨细胞的增殖有明显的抑制作用,浓度越大,抑制作用越明显。
③SCGE观察:T-2毒素组大鼠体外培养软骨细胞的拖尾率显著高于对照组,差异有统计学意义。随着T-2毒素剂量的增大,软骨细胞的尾DNA含量、尾长、尾动量均增加。
④免疫组织化学观察:T-2毒素组细胞发育不良,胞核固缩、胞膜破裂,各染毒组均有不同程度棕黄色染色。低剂量T-2毒素组染色最深,分泌基质金属蛋白酶能力最强;随着毒素剂量的增加,软骨细胞受损严重,MMP1分泌较少,染色变弱,以100ng/ml组最弱,染色最淡。
⑤光镜和透射电镜观察:正常组软骨细胞形态正常,有丰富的粗面内质网,核膜、细胞膜清晰;低剂量T-2毒素组软骨细胞胞体较小,细胞核固缩,细胞胞浆内细胞器减少。高剂量T-2毒素组软骨细胞表面微绒毛脱失,细胞核改变非常明显,可见线粒体的髓样变;粗面内质网扩张成囊状,脱颗粒,偶见凋亡的软骨细胞,细胞核固缩,形成高密度斑块。
结论:T-2毒素的毒性是非常强的,极小的剂量即可使体外培养的大鼠关节软骨细胞造成损伤,主要表现为软骨细胞DNA链断裂、细胞增殖抑制、细胞变性、坏死及凋亡,细胞功能受到损伤。