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由小麦叶锈菌(Puccina tirticina)引起的小麦叶锈病，是世界重要的一种小麦真菌病害，严重发生会造成40％甚至更大的产量损失。近些年，小麦叶锈病在我国发生严重，已成为华北及黄淮麦区的重要小麦病害。实践证明，控制小麦叶锈病最经济、安全、有效的方法是选育和利用抗病品种，然而叶锈菌毒性变异频繁，新的毒性小种的不断出现，往往导致抗叶锈性丧失。目前人们尚不清楚小麦抗叶锈病的机制，测序技术的迅速发展，便于抗病机制的研究。利用转录组测序(RNA-seq)技术研究该基因及其抗病机制对合理利用小麦抗叶锈性、可持续控制小麦锈病具有十分重要的意义。
本研究利用RNA-seq技术对小麦TcLr19及突变体接种小麦叶锈菌后的转录组进行分析，挖掘抗感病材料差异表达基因，分析参与抗病过程的关键代谢途径和基因;筛选EMS突变造成的SNPs，挖掘抗病相关位点，计算遗传距离构建遗传连锁图谱。主要研究结果如下:
1.利用RNA-seq技术对小麦抗叶锈近等基因系TcLr19及其感病突变体M433-3-11-2接种小麦叶锈菌后0、24、144h的转录组进行测序，每个样品平均得到88，404，575条clean reads，平均每个样品13.3G，87.45％的序列能定位到中国春小麦基因上。分别对TcLr19与M433-3-11-2接种后相同时间点(hour post inoculation，hpi)的差异表达基因以及同一材料在不同hpi的差异表达基因进行筛选，在接种后0、24和144h抗病近等基因系TcLr19与其感病突变体M433-3-11-2之间分别筛选到1964、5487和3395个差异表达基因;在TcLr19中筛选到差异表达基因25，858个，在感病反应中共筛选到差异表达基因49，235个。对不同对比组合的差异表达基因进行GO聚类和KEGG功能分析，结果表明，在小麦和叶锈菌的亲和与非亲和互作中，在不同hpi的差异基因的功能和参与的代谢途径等方面存在很大差异，差异基因富集到生物过程、细胞组分和分子功能几大类。
2.差异表达基因富集到抗病相关的植物——病原物互作、植物激素信号转导、次生代谢产物合成等通路，进一步分析发现许多差异表达基因在亲和及非亲和互作中均受到叶锈菌的诱导表达，同种类基因在TcLr19中的表达量要高于M433-3-11-2。这些差异基因富集到植物病原物互作过程中的许多关键基因，如:CDPK、CaM/CML、RPM1、PR1、JAZ等基因。另外，在这些差异表达基因中还发现了WRKY、NAC、bZIP等一些转录因子家族，可能与抗病相关。
3.对差异基因筛出的抗病相关基因进行克隆，并对其序列进行分析，构建系统进化树。其中克隆了2个钙调素相关基因CML，分别命名为TaCML22和TaCML25/26。TaCML25/26的ORF序列大小是458bp，预测其分子量为36.48kD，等电点为5.19;保守结构域预测表明TaCML25/26蛋白具有一个EF-hand8结构以及一个EFh_PEF家族结构。同源比对，发现粗山羊草与其同源性最高。TaCML22的ORF序列大小是663bp，预测其分子量为54.87kD，等电点为4.96;保守结构域预测表明TaCML22蛋白具有一个EFh_PEF家族结构，与粗山羊草同源性最高。克隆了1个JAZ相关基因，命名为TaTIFY10c。Ta TIFY10c的ORF序列大小是612bp，预测其分子量为49.17kD，等电点为5.11;保守结构域预测表明TaTIFY10c蛋白具有一个tify结构和一个CCT-2结构，同源性比对与与粗山羊草同源性最高。克隆了1个PR1相关基因，命名为TaPR1。TaPR1的ORF序列大小是522bp，预测其分子量为42.70kD，等电点为5.12;保守结构域预测表明TaPR1蛋白具有一个SCP结构，与普通小麦同源性最高。
4.利用TcLr19与M433-3-11-2转录组测序数据，与中国春小麦参考基因组比对后，共发现557，690个SNPs。进一步筛选，发现位于7DL染色体上有21，906个SNPs。选择亲本TcLr19与M433-3-11-2的三个重复筛选，两样本之间存在7320个SNPs。对这些SNPs所在基因Swissprot注释，含有抗病结构域NB-ARC基因的SNP共11个。SNP标记验证采用KASP技术，在120个F2∶3群体中，与抗感连锁的标记有一个，命名为A010067。根据苗期表型，计算遗传距离为7.9cM。
本研究利用RNA-seq技术对小麦TcLr19及突变体接种小麦叶锈菌后的转录组进行分析，挖掘抗感病材料差异表达基因，分析参与抗病过程的关键代谢途径和基因;筛选EMS突变造成的SNPs，挖掘抗病相关位点，计算遗传距离构建遗传连锁图谱。主要研究结果如下:
1.利用RNA-seq技术对小麦抗叶锈近等基因系TcLr19及其感病突变体M433-3-11-2接种小麦叶锈菌后0、24、144h的转录组进行测序，每个样品平均得到88，404，575条clean reads，平均每个样品13.3G，87.45％的序列能定位到中国春小麦基因上。分别对TcLr19与M433-3-11-2接种后相同时间点(hour post inoculation，hpi)的差异表达基因以及同一材料在不同hpi的差异表达基因进行筛选，在接种后0、24和144h抗病近等基因系TcLr19与其感病突变体M433-3-11-2之间分别筛选到1964、5487和3395个差异表达基因;在TcLr19中筛选到差异表达基因25，858个，在感病反应中共筛选到差异表达基因49，235个。对不同对比组合的差异表达基因进行GO聚类和KEGG功能分析，结果表明，在小麦和叶锈菌的亲和与非亲和互作中，在不同hpi的差异基因的功能和参与的代谢途径等方面存在很大差异，差异基因富集到生物过程、细胞组分和分子功能几大类。
2.差异表达基因富集到抗病相关的植物——病原物互作、植物激素信号转导、次生代谢产物合成等通路，进一步分析发现许多差异表达基因在亲和及非亲和互作中均受到叶锈菌的诱导表达，同种类基因在TcLr19中的表达量要高于M433-3-11-2。这些差异基因富集到植物病原物互作过程中的许多关键基因，如:CDPK、CaM/CML、RPM1、PR1、JAZ等基因。另外，在这些差异表达基因中还发现了WRKY、NAC、bZIP等一些转录因子家族，可能与抗病相关。
3.对差异基因筛出的抗病相关基因进行克隆，并对其序列进行分析，构建系统进化树。其中克隆了2个钙调素相关基因CML，分别命名为TaCML22和TaCML25/26。TaCML25/26的ORF序列大小是458bp，预测其分子量为36.48kD，等电点为5.19;保守结构域预测表明TaCML25/26蛋白具有一个EF-hand8结构以及一个EFh_PEF家族结构。同源比对，发现粗山羊草与其同源性最高。TaCML22的ORF序列大小是663bp，预测其分子量为54.87kD，等电点为4.96;保守结构域预测表明TaCML22蛋白具有一个EFh_PEF家族结构，与粗山羊草同源性最高。克隆了1个JAZ相关基因，命名为TaTIFY10c。Ta TIFY10c的ORF序列大小是612bp，预测其分子量为49.17kD，等电点为5.11;保守结构域预测表明TaTIFY10c蛋白具有一个tify结构和一个CCT-2结构，同源性比对与与粗山羊草同源性最高。克隆了1个PR1相关基因，命名为TaPR1。TaPR1的ORF序列大小是522bp，预测其分子量为42.70kD，等电点为5.12;保守结构域预测表明TaPR1蛋白具有一个SCP结构，与普通小麦同源性最高。
4.利用TcLr19与M433-3-11-2转录组测序数据，与中国春小麦参考基因组比对后，共发现557，690个SNPs。进一步筛选，发现位于7DL染色体上有21，906个SNPs。选择亲本TcLr19与M433-3-11-2的三个重复筛选，两样本之间存在7320个SNPs。对这些SNPs所在基因Swissprot注释，含有抗病结构域NB-ARC基因的SNP共11个。SNP标记验证采用KASP技术，在120个F2∶3群体中，与抗感连锁的标记有一个，命名为A010067。根据苗期表型，计算遗传距离为7.9cM。