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鸡柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)主要寄生在宿主盲肠的粘膜下,引起出血性肠炎,致病力强,严重影响养殖业健康发展。目前使用抗球虫药是防治肉仔鸡病的主要手段,但抗药性和药物残留等问题限制了球虫药物的广泛应用。研究表明重组球虫抗原免疫鸡后能产生一定的保护力,保护性抗原基因是其免疫功效的决定因素。球虫表面抗原基因sag10、λMZP5-7是重要的候选基因之一。λMZP5-7的免疫保护作用已被证实,sag10基因在子孢子入侵和裂殖子生殖阶段均有表达,具有潜在的研究价值。本实验目的是在甲醇营养型毕赤酵母中表达Eimeria tenella表面抗原基因,为研制有效球虫基因工程疫苗提供新的途径。同时也为下一步进行免疫保护研究提供材料。本文提取Eimeria tenella北京株第二代裂殖子总RNA,根据Genbank报道序列,编号L08257、AJ586552设计引物,应用RT-PCR技术扩增得到Eimeria tenella表面抗原基因λMZP5-7和sag10。与pGEM-T载体连接后测序,结果λMZP5-7与报道序列完全一致共948bp,编码315个氨基酸;pGEMT-sag10序列测定结果在NCBI上BLAST分析比较,结果表明,sag10基因编码序列与文献报道的序列同源性为99.01%,该球虫表面抗原基因全长708bp,编码236个氨基酸。其中有7个核苷酸与报道序列差异,4个氨基酸序列有差异。分别将λMZP5-7、sag10与真核表达载体pPIC9K连接,构建了pPIC9K-MZP和pPIC9K-sag10分泌型真核表达质粒,分别转化毕赤酵母GS115,利用G418抗性筛选多拷贝重组菌株,摇瓶水平进行诱导表达。SDS-PAGE和Western Blot进行检测,分别在大约36 KD和43kD处有明显的免疫印迹条带,结果MZP、SAG两种抗原蛋白得到表达,而且能被特异性抗体所识别,具有生物学活性。筛选到表达量最高的菌株S7在5L发酵罐进行优化表达,随着甲醇的诱导发酵上清中SAG10蛋白不断累积,当诱导120h后生物量达到最高354mg/mL,重组蛋白占总蛋白量的34%。