论文部分内容阅读
嗜酸性氧化亚铁硫杆菌（Acidichiobacillus Ferrooxidans）是一种重要的浸矿微生物，许多矿石中的萤石在酸性浸出环境下溶出较高浓度的氟离子，严重影响A.ferrooxidans菌的正常代谢及繁殖，从而抑制其在浸矿过程中的效率。因此，高抗氟的优良菌株可以有效提高矿石的浸出效率，对其抗氟的分子机理的研究利于人们对优良菌株进行分子改良，选育出高抗氟的优良菌株。 根据已报道的嗜酸性氧化亚铁硫杆菌的基因组，通过生物信息学分析发现，大多数A.ferrooxidans中也含有细菌中普遍存在的氟抗性相关基因crcB基因，已有的研究证明在部分细菌中crcB基因编码氟离子转运蛋白并和细菌的抗氟特性直接相关，但A.ferrooxidans菌中的crcB基因是否具有相同的作用需要进一步验证。我们通过分离纯化得到的两株不同的A.ferrooxidans菌株，一株抗氟，一株不抗氟，分别测定它们的抗氟能力，结果显示不抗氟菌在氟离子浓度为20mg/L的培养基中生长速率大幅弱于抗氟菌，不抗氟菌在氟离子浓度为60mg/L的培养基中完全不能生长，而抗氟菌仍能生长，但生长速率有所降低，氟抗性较差的暂定名为A.ferrooxidans BKF，具有较强的氟离子抗性的暂定名为A.ferrooxidans KF。 根据A.ferrooxidans ATCC23270全基因组序列，设计特异引物分别克隆上述两种菌株的crcB基因。通过PCR克隆获得A.ferrooxidans KF和A.ferrooxidans BKF菌中的crcB基因的全长序列。进一步进行序列比对和同源建模，获得了CrcB的理化性质及三维结构模型，结果显示A.ferrooxidans KF及A.ferrooxidans BKF菌中的CrcB蛋白之间存在三个氨基酸的差异，且其中第43、44位氨基酸的差异导致蛋白质的三维结构发生一定程度的改变，这些氨基酸的突变可能是导致其 CrcB的抗氟相关功能。通过Real-time Quantitative PCR分析A.ferrooxidans KF在氟胁迫下crcB基因的转录水平上的变化，结果显示相比无氟条件下，A.ferrooxidans KF的crcB基因在含氟条件下（氟离子浓度20mg/L）转录水平上调18倍，初步证明了crcB基因与A.ferrooxidans抗氟过程密切相关。由于A.ferrooxidans菌中的crcB基因所编码的是一种逆向转运蛋白，构建表达重组质粒 pET30a-crcB，转化表达宿主感受态大肠杆菌（E.coli BL21(DE3)），选取经测序验证正确后的重组菌在氟条件下诱导表达，以含空载质粒的大肠杆菌为对照，每组设三个平行，间隔两小时测OD值，结果显示含重组质粒 pET30a-crcB的重组菌在含氟培养基中的生长速度明显快于对照组，说明单基因crcB能起一定的抗氟作用。 本研究利用生物信息学分析了抗氟菌株和不抗氟菌株的CrcB的氨基酸序列差异，通过模拟三维结构初步分析了突变点的差异。在转录水平上分析了抗氟菌株在氟离子下 crcB基因的转录水平上的差异。在大肠杆菌中进行了异源表达，分析了crcB基因在大肠杆菌中可以起到一定的抗氟能力。后期将对两种菌株进行重测序及转录组分析，通过分析氟相关抗性基因的在转录水平上的差异，系统研究嗜酸性氧化亚铁硫杆菌的抗氟的分子机理。