论文部分内容阅读
背景白细胞介素-1(Interleukin-1,IL-1)包括两个不同的配体亚型：IL-1α和IL-1β,可与IL-1I型受体(IL-1type I receptor, IL-1RI)结合后通过G蛋白偶联机制发挥作用。IL-1α和IL-1β的生物学活性目前尚无法区分,IL-1α多以膜相关性显示其生物学活性,而IL-1β则多出现于血液循环中,目前认为IL-1β对心血管系统起主导作用。此外,体内还存在天然的IL-1受体拮抗剂(IL-1receptor antagonist,IL-1Ra),可通过竞争性结合IL-1RI从而抑制IL-1信号的传导。IL-1因为最初发现具有诱导兔子和人类发热的作用而被定义为“第一内源性致热原”。随着研究的深入,具有促炎性作用的IL-1β在多种心血管疾病中的重要作用逐渐被人们所认识。IL-1β参与动脉粥样硬化进展,包括：动脉粥样硬化局部病灶的形成、血管壁的炎症反应、斑块失衡、易损斑块破裂等—系列病理生理过程。IL-1β参与心肌梗死后炎症反应,增强基质金属蛋白酶的表达,并参与心肌不良重塑。最近,又有大量研究表明：IL-1β参与了心力衰竭的发生与发展：IL-1β参与心力衰竭过程中的炎症反应,对心肌产生直接的毒性作用,促进心肌细胞的凋亡,参与心力衰竭的左室重构等。心力衰竭是指由于心脏发生了结构或(和)功能(遗传性或获得性)异常,心室的充盈或(和)射血功能受损所导致的复杂的临床综合征。它同时伴有神经内分泌系统的激活、心肌重构等一系列异常机制,而心肌细胞凋亡正是其中重要的一环,同心力衰竭的发生、发展密切相关。作为终末分化细胞,心肌细胞的再生能力极其有限,其持续性死亡将不可避免的引发心力衰竭。而各种原因所导致的心功能恶化,往往又伴随着心肌细胞的反复丢失或(和)剩余心肌细胞收缩／舒张功能的逐渐恶化。因此,心肌细胞凋亡已被美国研究心力衰竭的special emphasis panel(SEP)推荐为今后心力衰竭防治重点研究领域之一。以往的研究表明：缺血性心肌IL-1β表达显著上调,而IL-1β又可诱导心肌肥大,引发心肌细胞凋亡。体内、外研究显示：IL-1β可激活新生大鼠心肌细胞的凋亡进程。给予大鼠移植入IL-1Ra高表达的心脏后,其经历缺血和再灌注损伤后的心肌梗死面积显著减少,心肌细胞凋亡减轻。接受重组人IL-1Ra阿那白滞素(anakinra)治疗的大鼠,其经历缺血/再灌注损伤后心肌细胞凋亡减少。虽然已有研究观察到了IL-1β对缺血心肌细胞凋亡的促进作用,但其具体分子机制,目前还知之甚少。Bishopric NH等研究后发现：IL-1β诱导大鼠心肌细胞凋亡是通过激活一氧化氮(Nitric oxide, NO)介导的Bak和Bcl-xL等BCL家族成员实现的。BCL家族为一组结构相似、与线粒体膜稳定性密切相关的家族蛋白,目前已知的BCL基因有10余种,根据功能的不同可分为抗凋亡基因和促凋亡基因两类,其中抗凋亡基因包括：BCL-2. BCL-XL、MCL-1、A1PBFL-1、BCL-W等,促凋亡基因包括：BAX、BCL-Xs、BAK、BAD、BIK、BIM、BID、 HRK、BOK等。BCL家族促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的相对比值是凋亡调控的“变阻器”。有研究显示：BCL-2:BAX<1:2时细胞发生凋亡,反之则细胞存活。BCL家族对凋亡的调控作用主要是通过影响线粒体膜稳定性来实现的,BCL家族蛋白之间可相互作用形成同源或异源二聚体,构成复杂的调控网络,调控线粒体跨膜电位(mitochondrial transmembrane potential,ΔΨm)的开放和线粒体通透性转化孔(mitochondrial permeability transition pore, MPTP)的变化,从而调节线粒体膜间隙中多种效应蛋白的释放,对细胞凋亡产生重大影响。但是目前大家的认识仅停留在：对于大鼠心肌细胞而言,IL-1β可通过N0途径激活BCL家族蛋白的表达,引发细胞凋亡。本研究的目的旨在阐明IL-1β对心肌细胞凋亡的诱导及其相关分子机制。实验对象为新生小鼠心肌细胞,首先分离提纯新生小鼠心肌细胞,然后体外实验观察IL-1β对该细胞凋亡的诱导；全面检测了心肌细胞凋亡进程中促凋亡效应分子的表达变化,包括天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(cysteine-containing aspartate-specific proteases,caspase)依赖和非依赖途径,并对凋亡过程中胞内相关抗凋亡分子——凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)的表达也进行了观察。本课题的研究发现有望为临床阻断心肌细胞凋亡、延缓心衰发展和保护心功能提供新的靶点。研究对象新生小鼠心肌细胞,均取自健康的新生C57BL/6J小鼠,1-3日龄,6～9g,清洁级,购自中国科学院上海实验动物中心,或由购自该中心的成年雌、雄性C57BL/6J小鼠交配所生。本研究改良了常规啮齿类动物心肌细胞的分离方法,联合胶原酶和胰蛋白酶以消化离体的新生小鼠心肌组织,并通过差速贴壁分离和化学试剂抑制的方法获得纯化的小鼠心肌细胞。将分离纯化成功的小鼠心肌细胞进行体外培养3～5天后,进行IL-1β诱导实验,设立实验组与对照组,实验组：加入lOng/ml重组鼠IL-1β,培养72小时；对照组：无IL-1β的常规培养。本系列研究共分以下两部分。第一部分IL-1β对新生小鼠心肌细胞凋亡的诱导作用目的：体外给予IL-1β刺激,以观察心肌细胞的凋亡情况,重点关注caspase依赖性凋亡途径。方法：IL-1β诱导实验结束后,消化心肌细胞,并进行Annexin V免疫荧光染色,流式细胞术(Flow cytometry)检测心肌细胞的凋亡情况；蛋白质印迹法(Western Blot)检测心肌细胞active (cleaved)caspase-3的表达情况。结果：1、与对照组(无IL-1β培养)相比,实验组的小鼠心肌细胞呈现较高的Annexin V阳性率,即具有较高的细胞凋亡率(实验组：36.7±8.4%,对照组：5.5±2.3%,p=0.0034)2、实验组小鼠心肌细胞(经l0ng/m1IL-1β刺激72小时后)表达active caspase-3,而对照组则不表达active caspase-3。结论：IL-1β可诱导体外培养的新生小鼠心肌细胞发生凋亡,IL-1β在诱导心肌细胞凋亡过程中可激活caspase依赖性途径。第二部分IL-1β对小鼠心肌细胞caspase非依赖性凋亡途径和凋亡抑制蛋白家族的调控目的：阐明IL-1β在小鼠心肌细胞凋亡进程中对caspase非依赖性途径和IAPs家族分子表达的影响。方法：IL-1β诱导实验结束后,应用实时定量PCR(real-time quantitative PCR)技术检测心肌细胞caspase非依赖性途径中主要效应分子的表达变化,其中包括第2种线粒体来源的激活剂(secondmitochondria-derived activator of caspase,Smac/DIABLO)、高温相关丝氨酸蛋白酶A2(high temperature requirement A2, HtrA2/0mi)、核酸内切酶G (Endonuclease G, Endo G)和凋亡诱导因子(Apoptosis-inducing factor, AIF);同时检测了心肌细胞IAPs的表达情况,其中包括细胞凋亡蛋白抑制物-1(cellular inhibitor of apoptosis1, c-IAP1)、细胞凋亡蛋白抑制物-2(cellular inhibitor of apoptosis2,c-IAP2)、X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP)、生存素(survivin)。结果：1、与对照组相比,IL-1β可诱导体外培养的心肌细胞高表达Endo G和HtrA2/0mi mRNA (Endo G:p=0.0084, HtrA2/0mi:p=0.0483),但在Smac/Diablo和AIF的表达上,两组之间却未见有明显差异(p>0.05)。2、与对照组相比,IL-Iβ可在体外抑制心肌细胞survivin和XIAP mRNA的表达(survivin:p=0.0001, XIAP:p=0.0069),而对于IAPs家族的另2个成员——c-IAP1和c-IAP2,其mRNA的表达则增加(c-IAP1：p=0.0227,c-IAP2:p=0.0003)。结论：1、IL-1β在诱导心肌细胞凋亡过程中可激活caspase非依赖性途径。IL-1β通过促进Endo G和HtrA2/0mi的表达,诱导心肌细胞caspase非依赖性凋亡途径的激活,发生凋亡。2、IL-1β可通过抑制IAPs家族中的survivin和XIAP的表达,间接促进心肌细胞发生凋亡,但在诱导心肌细胞凋亡的过程中,IL-1β对IAPs家族成员的这一调控作用是有选择性的。综合第一、二部分研究结果,本研究证实：IL-1β可通过激活caspase依赖性和非依赖性途径,诱导体外培养的新生小鼠心肌细胞发生凋亡；在这一过程中,IL-1β还可通过精密调控IAPs家族成员的表达,间接促进心肌细胞发生凋亡。这一发现,在已发表的研究中未见有报道。IL-I作为慢性心衰患者心肌中主要的炎性因子,参与了从心肌细胞凋亡至心衰终末期的一系列病理生理进程,深入研究IL-1β介导心肌细胞凋亡的具体机制及其内在关联,有助于为心力衰竭等心脏疾病的治疗寻找新的靶点,也将为临床相关患者的康复带来希望。