膜联蛋白Ⅴ的基因克隆及蛋白性质研究

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目的从人胎盘中分离出膜联蛋白V(AnnexinV,AnxV)的基因,表达并分离纯化出GST-AnxV融合蛋白,初步凝血酶切割,并纯化出Anx蛋白,对GST-AnxV融合蛋白、Anx蛋白的生化性质进行研究。方法利用RT-PCR技术从新鲜的人胎盘组织的总RNA中扩增出AnnexinV的基因编码序列,通过PCR技术分别构建AKP-AnxV融合基因和GST-AnxV融合基因。摸索表达条件,在25℃的条件下低温诱导表达GST-AnxV融合蛋白,摸索纯化条件,利用GST亲和层析柱分离、纯化GST-AnxV融合蛋白,并经过凝血酶酶切,初步纯化得到AnnexinV蛋白。通过活化部分凝血活酶时间(APTT)实验测定GST-AnxV融合蛋白、Annexin蛋白的抗凝活性并绘制量效曲线。结果成功利用RT-PCR技术从新鲜的人胎盘组织的总RNA中扩增出AnnexinV的基因编码序列,经1%琼脂糖凝胶电泳后得到分子量约为960bp的条带,经DNA测序后,其基因序列与预期一致。成功利用PCR技术分别构建了AKP-AnxV融合基因(分子量约为2242bp)和GST-AnxV融合基因(分子量约为1669bp),并成功克隆到表达载体中。通过摸索和优化表达条件,成功表达出可溶的GST-AnxV融合蛋白,利用GST亲和层析柱分离、纯化GST-AnxV融合蛋白(分子量约为61kDa)。并经过凝血酶酶切,初步纯化得到AnnexinV蛋白(分子量约为35kDa)。通过活化部分凝血活酶时间(APTT)实验测定,GST-AnxV融合蛋白、AnnexinV蛋白都能有效延长APTT时间,绘制量效曲线后发现延长时间与剂量成线性关系。结论从人胎盘中初步纯化得到GST-AnxV融合蛋白、AnnexinV蛋白,其抗凝性质显著。
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