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研究背景DADS是从大蒜中分离出的脂溶性单体有机硫化合物，可通过抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡和细胞周期停滞等方式抑制多种肿瘤细胞的生长。前期的研究显示：DADS能诱导HL-60细胞生长阻滞在G2/M期，但机制尚不完全清楚。cyclinB1是细胞周期G2/M期的特异性周期素，是唯一随细胞周期变化而发生亚细胞分布改变的细胞周期素，cyclinB1的核转位是启动细胞有丝分裂的必要条件。p21是细胞周期蛋白依赖性激酶(cycledependentkinase，CDK)抑制剂，可与CDK、cyclinB1和增殖细胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen，PCNA)形成四元复合物，在细胞周期推进过程中发挥重要作用。研究表明：p21与cyclinB1诱导细胞G2/M期生长阻滞可能涉及如下两种机制：形成p21-PCNA-cdc2/cyclinB1四元复合物竞争性抑制cdc25与PCAN结合，阻断cdc25催化cdc2去磷酸化；这种四元复合物阻断cdc2活化激酶(cdc2activatingkinase，CAK)磷酸化cdc2，以上两种机制协同抑制cdc2激酶的活化，诱导细胞G2/M期生长阻滞。但是迄今为止，cyclinB1亚细胞分布和p21在DADS诱导肿瘤细胞G2/M期生长阻滞中的作用尚未得到证实。方法用20μMDADS处理HL-60细胞，MTT法测定DADS对HL-60细胞增殖活性的影响，流式细胞术测定DADS对细胞增殖周期的影响，Westernblot测定DADS对cyclinB1亚细胞分布、p21与c-myc的表达水平的影响，免疫共沉淀分析cyclinB1与p21两者相互作用，重组质粒pcDNA3-c-myc和对照空质粒pcDNA3分别转染HL-60细胞，用流式细胞术、Westernblot以及丫啶橙染色法检测p21受到抑制后，DADS对细胞增殖周期和细胞命运的影响。结果为了探讨DADS对HL-60细胞增殖的影响，经20μMDADS、DMSO、及10nM全反式维甲酸(ATRA)孵育HL-60细胞24h，结果显示：DADS能抑制HL-60细胞增殖，20μMDADS对细胞增殖的抑制率与ATRA(10nM)对细胞的抑制率接近。为了确定DADS阻滞HL-60细胞周期时相，用流式细胞术检测细胞周期分布，结果显示：DADS处理HL-60细胞12h，G2/M期细胞百分数平均值上升到最大值(37.6％)。提示：DADS能抑制HL-60细胞增殖并活化细胞增殖周期G2/M期检测点。
Cdc2/cyclinB1是细胞进入有丝分裂的始动因素，且cyclinB1核转位是细胞启动有丝分裂必要条件，为了探讨cyclinB1的亚细胞分布与DADS诱导细胞G2/M期生长阻滞的关系，用20μMDADS处理HL-60细胞。结果显示：cyclinB1表达逐渐增强，DADS处理HL-60细胞12h，细胞质cyclinB1表达达到高峰，而此时细胞核cyclinB1表达明显受到抑制。提示：cyclinB1胞质定位与DADS诱导HL-60细胞G2/M期检查点有关。
为了探讨p21在DADS启动G2/M期检查点中的作用，20μMDADS处理HL-60细胞0h～24h。结果显示：DADS能诱导HL-60细胞p21表达，至12h时达高峰。为了解p21与cyclinB1的存在状态及相互作用，用抗cyclinB1抗体沉淀DADS处理12h的HL-60细胞总蛋白，经ProteinA/GPLUS-Agarose处理，用抗p21单克隆抗体作为检测抗体，进行蛋白质免疫印迹。结果显示：cyclinB1能被p21抗体沉淀，p21与cyclinB1以复合物的形式存在，p21通过与cyclinB1结合，发挥其生物学效应。这些结果提示：p21可能与DADS启动HL-60细胞G2/M期检查点有关。
为了进一步证实p21在DADS活化HL-60细胞G2/M检查点中的作用，将pcDNA3-c-myc和pcDNA3分别转染HL-60细胞，结果显示：转染c-myc质粒的HL-60细胞能稳定表达c-Myc，此时转染c-myc质粒的HL-60细胞p21表达降低。提示：c-Myc能够抑制DADS诱导HL-60细胞p21表达。为了探讨c-Myc下调p21的表达对DADS启动HL-60细胞G2/M期检查点的作用，用流式细胞术检测细胞周期分布。结果显示：DADS处理上述细胞12h后，c-myc转染的HL-60细胞G2/M期细胞百分数下降到22.7％，而空质粒pcDNA转染的HL-60细胞G2/期细胞百分数为37.6％，并且，未加DADS处理HL-60细胞G2/M期细胞百分数为20.3％。这些结果提示：当c-Myc内源性表达上调抑制HL-60细胞p21的表达时，能逆转DADS诱导的HL-60细胞的G2/M期阻滞。
为了进一步确定c-Myc下调p21的表达对HL-60细胞命运的影响，采用丫啶橙染色观察HL-60细胞凋亡形态。结果显示：DADS处理c-myc转染12h的HL-60细胞呈现明显凋亡特征：细胞膜以及核膜保持完整，细胞核浓缩。上述结果提示：当c-Myc内源性表达上调抑制p21表达时，DADS能够诱导HL-60细胞凋亡。结论1.DADS活化HL-60细胞G2/M期检查点与cyclinB1蛋白高表达和细胞质定位有关。2.DADS能诱导HL-60细胞p21的表达和p21-cyclinB1的形成。3.DADS活化HL-60细胞G2/M期检查点与p21的表达有关；当c-Myc内源性表达上调抑制p21表达时，能逆转DADS诱导的HL-60细胞的G2/M期阻滞，诱导HL-60细胞凋亡。