论文部分内容阅读
随着人类基因组计划的完成，有关个体遗传变异与疾病的关系日益受到重视，单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)是人类基因组中遗传学变异中最常见的一种类型，也是决定不同个体临床表型多样性的重要因素。因此对复杂性疾病进行SNPs研究对于临床上早期诊断、预防和治疗这类疾病有重要意义。
银屑病(俗称牛皮癣)是一种发病率高、易反复、治疗困难的常见皮肤病。尽管一般情况下银屑病不会威胁到患者的生命，却严重影响着患者的生活质量、工作效率和身心健康。
以往认为，银屑病的病因和发病机理与遗传、感染、代谢障碍、内分泌、神经精神和免疫等多种因素有关。后有研究发现，环境因素在银屑病的发生和发展过程中也起重要作用。现在一致公认，银屑病是一种由多基因遗传决定、多种环境因素刺激诱导的免疫异常性慢性炎症性增生性皮肤病。即遗传背景的多样性影响基因功能，在环境因素的作用下，激发机体的细胞免疫应答，产生以CD4+T细胞介导的自身免疫紊乱，从而导致患病。
目前，已有研究表明FOXP3基因及其所影响的CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞(CD4+CD25+FOXP3+regulatory T cells，Tri-Treg)参与了许多自身免疫性疾病的发病机制。Tri-Treg数量降低，尤其是其与效应性T(effectiveness T Cell，Te)细胞之间免疫失衡，导致Te细胞过度活化，是重型及进展期寻常型银屑病(psoriasis vulgaris，PV)病程发展中的核心环节。
近期国内已报道，FOXP3基因中个别SNPs位点与银屑病发病有相关性。但是，对于受多基因影响的复杂性自身免疫性疾病，我们有必要进行大样本、多位点SNPs检测，并在此基础上对FOXP3转录调控进行研究，为机制研究提供更多更可靠的靶项分子。
为此，我们选择与免疫性疾病发病密切相关的FOXP3基因，拟在中国PV人群中筛查其SNPs频率分布，并对阳性关联位点的生物学意义进行初步实验研究。
本研究收集408例PV患者及363例正常对照，采用问卷调查，多因素logistic回归分析寻找出与PV发病相关的危险因素。
采用聚合酶链式反应-连接酶检测(polymerase chain reaction and ligase detectionreaction，PCR-LDR)方法，在中国PV人群中，对FOXP3基因4个SNPs候选位点(rs2232365，rs3761547，rs3761548，rs3761549)进行病例-对照研究。
等位基因频率直接由基因型计算，Hardy-Weinberg平衡由x2检验检测，以P>0.05为符合Hardy-Weinberg平衡，两组间差异由列联表x2检测，通过LDA软件检测连锁不平衡，位点间交互作用使用x2检测，P<0.05为有统计学意义。所有数据的计算使用统计分析系统(version9.0，SAS Institute Inc，Cary NC)
对与PV相关的FOXP3基因阳性SNP位点(rs2232365，rs3761547A，rs3761549)进行初步的功能研究，即通过实时定量-PCR(realtime-PCR，RT-PCR)法，对比白介素2(Interleukin2，IL-2)体外干预前后不同基因型PV患者中FOXP3 mRNA的表达水平，分析不同基因型对FOXP3基因内含子1区中基因核酸转录的影响。
研究主要结果如下：
1.本次研究发现，有家族史(p<0.001，OR=3.12，95％CI=2.40-4.07)和40岁以前发病(p<0.001，OR=1.12，95％CI=0.92-1.38)仍然是严重影响PV发病的因素；一些环境因素也是PV发病的危险因素：吸烟(p<0.001，OR=3.91，95％CI=2.68-5.71)，饮酒(偶尔饮酒：p=0.037，OR=1.46，95％ CI=1.02-2.09；戒酒：p<0.001，OR=5.37，95％CI=3.21-8.98；继续饮酒：p<0.001，OR=11.90，95％ CI=7.08-19.98)；失业(p=0.0175，OR=3.72，95％CI=1.26-10.97)、未婚(p<0.0001，OR=3.93，95％CI=2.80-5.52)、睡眠不足(time<5h：p<0.0001，OR=56.61，95％ CI=13.56-236.36；8h>time>5h：p<0.0001，OR=10.30，95％ CI=7.16-14.82)以及在城市以外的居住地点(p<0.001，郊区：OR=3.72，95％CI=2.06-6.72；县城：OR=40.56，95％CI=6.27-101.14；农村：OR=26.80，95％CI=10.65-67.47)，月经紊乱(p=0，OR=3.86，95％CI=1.88-7.92)。
2.在408例PV患者及363例正常对照中，采用PCR-LDR对FOXP3基因4个SNP位点(rs2232365，rs3761547，rs3761548，rs3761549)进行分型，结果发现rs2232365，rs3761547和rs3761549等位基因和基因型频率在PV患者及正常对照组中的分布存在显著差异(p值均<0.05)。
低频纯合子(低频等位纯合基因型)(rs2232365 GG，rs3761547 GG，rs3761549TT)是PV发病的保护性基因型，对应高频纯合子是危险基因型。携带保护性基因型的个体患PV危险性将显著降低rs2232365 GG：p=0.0206，adjusted OR=0.32，95％CI=0.17-0.86；rs3761547 GG：p=0.0288，adjusted OR=0.30，95％CI=0.10-0.88；rs3761549TT：p=0.0399，adjusted OR=0.330，95％CI=0.12-0.95。
3.联合各样本基因型进行分层分析，研究基因多态性与PV临床表型的相关性，结果显示：分别以rs2232365 AA，rs3761547AA和rs3761549 CC基因型为参照，多因素Logistic回归分析发现，携带三个与疾病关联位点中rs2232365，rs3761547和rs3761549的G等位、G等位、T等位，可以降低发病年龄<40岁患者的发病率，并可以明显缓解女性群体的发病；三个阳性位点中的低频等位纯合子对有家族史患者发病有降低作用；rs3761547 AG+GG和rs3761549 CT+TT基因型将显著降低不伴有代谢性疾病人群中PV发病风险性。
4.本实验首次发现FOXP3基因的功能性SNP位点rs3761548与PV的发病无相关性。
5.对rs2232365(位点1)，rs3761547(位点2)和rs3761549(位点4)进行连锁不平衡分析提示，三个位点存在连锁(分别为D’1，2=0.8794，r2=0.3927；D’1，4=0.9924，r2=0.4223；D’2，4=0.9306，r2=0.9455)。
6.对FOXP3基因的多态性位点之间的交互作用进行分析，统计结果显示三个阳性位点之间两两存在交互作用，rs2232365与rs3761547、rs2232365与rs3761549C/T、rs3761547与rs3761549之间的联合型在患者和健康对照之间的分布存在显著差异(p值分别为0.0356，0.0004和0.0043)。其中FOXP3-rs2232365 AA-3761547 AG+GG联合基因型可增加PV发病危险性2.897倍(校正后p=0.0393，95％CI=1.05-1.97)，而rs2232365AG+GG-rs3761547AG+GG(p=0.0019，adjusted OR=0.59，95％CI=0.42-0.82)、rs2232365AG+GG-rs3761549CT+TT(p=0.0012，adjusted OR=0.57，95％CI=0.41-0.80)、rs3761547AG+GG-rs3761549CT+TT(p=0.0027，adjusted OR=0.62，95％CI=0.45-0.85)联合基因型显著降低PV发病率。分别提示各位点之间具有联合效应。
7.采用配对和非独立样本t检验，对IL-2干扰前后外周血白细胞中FOXP3基因mRNA表达量进行统计学比较，结果发现当等位基因改变时，携带保护型基因患者血中FOXP3 mRNA的表达量明显增高。与FOXP3基因三个阳性关联SNP位点的保护基因型可降低PV患病风险的研究结果一致。
综上所述：本研究通过在中国人群中进行病例-对照研究，发现FOXP3基因rs2232365，rs3761547，rs3761549位点多态性与中国人群PV发病相关，三个阳性位点中低频率等位是保护性等位，而高频等位基因是危险性等位。这三个位点存在连锁，rs2232365 AA-3761547 AG+GG能显著增加PV患病的风险。FOXP3基因三个阳性位点中高频率等位基因可能是通过下调FOXP3基因的表达而增加了PV发病风险。同时，本实验还发现，伴有家族史和发病年龄在40岁以前是PV发病的危险因素；一些环境因素对PV的发病有密切关系，在城市以外的居住环境下、未婚状态、失业状况女性激素水平紊乱与PV的发病呈正向关，那些吸烟与饮酒者也更易患PV。
总之，本研究表明FOXP3基因的SNPs与PV发病相关，该基因的SNP可能通过影响转录水平而导致发病。一些环境因素与PV发病有密切的关联。支持遗传与环境共同作用学说是银屑病重要的发病机理之一。