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目的：
1.建立转线粒体细胞模型
2.观察糖尿病家系融合细胞线粒体外部形态及初步功能表现
对象与方法：
1.研究对象含T10003C突变位点的糖尿病家系病人1例,2名正常对照(男、女各1例)。
2.细胞系及培养p0HeLa细胞由吕斌老师惠赠。p0HeLa细胞培养基为高糖DMEM,含10％胎牛血清,补加尿嘧啶50μg/ml和丙酮酸钠100μg/ml。选择培养基为高糖DMEM,含10％透析的胎牛血清。细胞培养于37℃,含5％CO2的孵育箱中,每2～3天换液1次,每周传代1～2次。
3.通过选择培养基(不含尿嘧啶和丙酮酸盐)初步鉴定p0HeLa细胞。
4.提取细胞全基因组DNA,普通PCR扩增及Real-time PCR(TaqMan法)进一步验证p0HeLa细胞。
5.通过透射电镜观察正常HeLa细胞、p0HeLa细胞,进而观察两者之间差异,从细胞形态学直观鉴定p0HeLa细胞。
6.以聚乙二醇为促融剂,采用无线粒体DNA的p0HeLa细胞与血小板进行融合。分离快速生长的单克隆细胞。
7.提取细胞全基因组DNA,PCR扩增mtDNA第10003位所在片段,通过PCR扩增鉴定融合后细胞。
8.透射电镜观察融合后细胞线粒体形态。
结果：
1.对数生长期p0HeLa细胞,换用选择培养基培养,观察细胞生长、形态及死亡情况。培养一周后p0HeLa细胞明显肿胀,轮廓增强,多数悬浮死亡。培养2周左右,细胞虽有部分存活,但较前明显减少,细胞之间拉丝明显,核内容物高倍镜下解体。培养3周左右细胞聚集成团,轮廓清晰。培养4周左右,细胞几无残活。但同时用含尿嘧啶或丙酮酸钠培养基,细胞生长较好,四至五天须消化传代。表现出对尿嘧啶和丙酮酸盐的依赖性。
2.PCR产物电泳结果显示正常HeLa细胞及融合细胞出现940bp的目的条带,但p0HeLa细胞无相应条带。从而初步提示p0HeLa细胞株为mtDNA缺失的细胞株,融合细胞有功能性的mtDNA。Real-time PCR结果显示经过40个循环未检测到mtDNA,但正常HeLa细胞呈现正常拷贝数(108)。进一步说明此细胞株已无mtDNA残留。
3.透射电镜结果示p0HeLa细胞镜下线粒体嵴破坏,仅残留部分,部分甚至缺如。线粒体出现空泡改变,核形态基本正常。正常hela细胞线粒体较多,呈圆形或椭圆形,基质较致密,嵴清晰。融合后细胞线粒体部分呈现空泡改变。
结论：
1.以聚乙二醇(PEG)为融合剂,介导血小板与p0HeLa细胞融合,构建了转线粒体细胞株。
2.融合后细胞从形态学上来说:从电子(相差)显微镜观察,细胞融合前后均呈现梭形贴壁生长；从透射电镜观察细胞,部分线粒体呈现线粒体嵴恢复,部分出现空泡改变。