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极端嗜热古菌硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus P2)含有三个有活性的复制原点和三个真核类似的Orc1/Cdc6蛋白(命名为SsoCdc6-1， SsoCdc6-2和SsoCdc6-3)，因此成为研究真核生物复杂DNA复制机制的理想材料。但是目前还不清楚古菌的这种多个Orc1/Cdc6蛋白之间能否通过功能性的相互作用共同来调控DNA复制起始。本研究采用纯化的复制起始蛋白SsoCdc6及其突变体，在体外比较研究了它们与两个复制原点DNA之间的相互作用，特别是首次对古菌的多个SsoCdc6蛋白相互调控它们与原点DNA的相互作用进行了系统的生化分析。本研究主要取得了以下几个方面的结果：
1.构建了SsoCdc6-2蛋白和SsoCdc6-2的C-末端缺失体(SsoCdc6-2△C)的大肠杆菌表达菌株，并通过热处理和Ni-NTA镍琼脂糖凝胶亲和纯化等步骤获得纯度达99％以上的SsoCdc6蛋白和SsoCdc6△C蛋白；针对S.solfataricus复制原点oriC1和oriC2的结构特征，设计了分别包括分叉和平端两种结构的三组特异性DNA底物。这些底物的共同特征是含有相互重叠的SsoCdc6结合位点。
2.通过一系列电泳迁移率改变实验(EMSA)，发现SsoCdc6-1能够刺激SsoCdc6-2和SsoCdc6-3的DNA结合活性；相反，SsoCdc6-3抑制SsoCdc6-1与DNA底物的结合。而且它们的C-末端缺失体(SsoCdc6△C)基本保留了这种类似的调控功能。因此，三个SsoCdc6蛋白能够相互调控(正调控或者负调控)各自对原点特异性DNA的结合。
3.采用Pull-down/Western blot分析，发现了如下几组蛋白间物理性的相互作用：SsoCdc6-1/SsoCdc6-3，SsoCdc6-1△C/SsoCdc6-3，SsoCdc6-1/SsoCdc6-2，SsoCdc6-1△C/SsoCdc6-2，SsoCdc6-2/SsoCdc6-3，SsoCdc6-2/SsoCdc6-3△C。另外，采用细菌双杂交技术，检测到了三个SsoCdc6蛋白与另一个复制起始蛋白SsoMCM均能发生物理的相互作用。
4.构建了SsoCdc6-2蛋白WalkerA模体的定点突变体(SsoCdc6-2KA)的大肠杆菌表达菌株，通过优化表达条件获得了重组蛋白。进一步的EMSA实验表明，SsoCdc6-2KA保留了结合DNA的特性但失去了自磷酸化的功能。
DNA复制过程是个十分复杂的过程，它需要蛋白质-蛋白质之间和蛋白质-DNA之间高度协调性的相互作用。极端嗜热古菌S.solfataricus的DNA复制机制是目前研究的热点和前沿，本研究首次系统阐明的古菌多个复制起始蛋白Orc1/Cdc6之间功能性的相互作用机制等研究成果，不仅对于我们深入理解这种古老微生物本身的DNA复制及遗传规律奠定了基础，同时也为最终阐明真核生物复杂的DNA复制调控机制提供了重要线索。