【摘 要】
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骨形态发生蛋白(Bone Morphogenesis Proteins,BMPs)是一类具有诱骨活性的蛋白质生长因子。骨形态发生蛋白.4(BMP4)是BMPs中诱导成骨活性较强的一种。目前已有研究者尝试在不
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骨形态发生蛋白(Bone Morphogenesis Proteins,BMPs)是一类具有诱骨活性的蛋白质生长因子。骨形态发生蛋白.4(BMP4)是BMPs中诱导成骨活性较强的一种。目前已有研究者尝试在不同的表达系统中进行重组表达,但是在表达产物中,无法获得活性较高的二聚体形式的蛋白。BMP4在胞内是以前体的形式合成的,包括信号肽、前导肽和成熟肽三个部分。研究表明,在目前发现的绝大部分的以含前导肽的前体形式合成的蛋白质在其前导肽不存在的情况下均无法正确折叠。因此认为,Pro肽在某些蛋白质的折叠过程中扮演了分子内分子伴侣(IMC)的角色。本研究希望在毕赤酵母中将BMP4前导肽与成熟肽融合表达,以此来探讨BMP4前导肽在辅助成熟肽的折叠以及二硫键的配对过程中是否起到一定的作用。主要的研究工作和研究结果包括:(1)将hBMP4前导肽与成熟肽片段克隆到分泌型表达载体质粒pPIC9K多克隆位点上,构建能表达hBMP4前导肽与成熟肽的重组质粒pPIC9K-hBMP4/pro-ori;(2)以这一表达载体为基础,对hBMP4前导肽与成熟肽之间内源性蛋白水解酶识别位点进行定点突变,将真核细胞中碱性氨基酸蛋白酶(furin)识别的位点(RXXR)改为酵母细胞中丝氨酸蛋白酶(Kex2P)识别的位点Kex2,并以此构建了重组质粒pPIC9K-hBMP4/pro-mut;(3)表达质粒经转化酵母宿主菌株GSll5,PCR鉴定基因整合后,摇瓶培养,甲醇诱导表达并用点杂交来快速筛选高表达菌株。表达产物经SDS-PAGE和Western blotting分析表明表达产物具有良好的抗原性和特异性,内源性蛋白水解酶识别位点的改造能够使前导肽有效切割,切割后BMP4成熟肽的分子量为22KD,与标准蛋白一致,但不存在同二聚体形式的产物。
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