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研究背景
糖尿病皮肤溃疡(diabetic cutaneous ulcers，DCU)是指糖尿病患者由于长期血糖控制不良，进而引起神经病变及不同程度的各种末梢血管病变而导致下肢感染、溃疡形成和深部组织的破坏[1,2]。DCU患者创面迁延不愈，反复的感染，需要长期的伤口护理，严重的致死致残，这些都严重影响患者的正常生活，也给社会带来巨大经济负担[3,4]，因此对糖尿病皮肤溃疡治疗的研究具有重要的临床应用价值。目前的治疗方法仍以手术治疗为主，已有的生物和物理的治疗方法都存在诸多局限性，未能达到满意的治疗效果。
前期研究发现造血前列腺素D合成酶(hematopoietic prostaglandin D synthase，HPGDS)在糖尿病创面中的表达下调。HPGDS主要表达于造血细胞系细胞，如肥大细胞和Th2细胞，其主要作用是催化免疫系统中前列腺素D2(prostaglandin D2，PGD2)的生成。PGD2通过过氧化物酶体增殖物激活受体γ的激活来调节炎症反应[5]，能够抑制iNOS，TNF-α和IL-1β以及巨噬细胞的浸润，还能调节小鼠T细胞和B细胞的凋亡来减轻炎症反应[6,7]。因此推测HPGDS表达下调阻碍了糖尿病溃疡组织中炎症反应的消退，炎症微环境的紊乱抑制了溃疡的修复。因此调控糖尿病溃疡组织中HPGDS的表达可能成为促进其修复的新靶点。
为了提高脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSC)在糖尿病溃疡中的治疗效果，以ADSC为载体过表达HPGDS，有针对性的增强ADSC在糖尿病溃疡中的免疫调节功能。由于糖尿病慢性溃疡处组织缺损、缺乏血供、炎症反应剧烈，导致移植成活率较低，从而限制了脂肪间充质干细胞的临床应用。本研究采用的RGD肽修饰的VitroGel3D水凝胶支架可以通过物理分离保护自身免受宿主免疫系统的侵害[8]，从而为移植ADSCHPGDs的粘附和生存提供适当的理化微环境，优化糖尿病创面中干细胞移植治疗的效果。基因和细胞疗法的结合将改善糖尿病创面的免疫和再生的微环境，加速慢性创面的愈合。本研究可为皮肤组织工程种子细胞的改进提供重要的理论基础，也为糖尿病慢性溃疡的创面免疫调节提供了重要的临床应用前景。
研究目的
1.通过生物信息学分析寻找糖尿病创面组织中发生改变的关键分子，明确糖尿病创面免疫微环境的特征;
2.探索过表达Hpgds对hADSC生物学特性(干细胞标志、增殖、迁移、分化、凋亡)的影响;
3.探讨hADSCHpgds复合RGD肽修饰的VitroGel3D水凝胶支架在糖尿病小鼠创面愈合中的作用及其机制。
研究方法和结果
1.糖尿病创面生物信息学分析及其免疫微环境特征
方法:从NCBIGEODatasets中获取人正常皮肤组织和糖尿病溃疡组织的高通量芯片数据，对其进行基因本体(Gene Ontology，GO)分析、蛋白互作网络分析，筛选关键信号分子;通过Real-timePCR对比检测正常小鼠和糖尿病小鼠创面愈合过程中Hpgds的动态表达差异;利用HpgdssiRNA在正常小鼠创面中敲低Hpgds，与PBS组和controlsiRNA组对比，观察Hpgds敲低后对正常小鼠创面愈合的影响;在0h、8h、2d、6d、10d、14d时取材提取组织总RNA，采用RNA-seq和ImmuCC计算模型检测糖尿病小鼠创面中免疫相关通路的活性，对比糖尿病小鼠和正常小鼠炎症因子和免疫细胞组分的动态变化。
结果:筛选到糖尿病皮肤细胞表达上调基因21个，表达下调的基因22个。GO分析结果显示糖尿病溃疡组织的差异基因主要富集于角质细胞分化、角质化、肽交联、表皮发育、中间纤维细胞骨架组织、谷胱甘肽衍生物的生物合成过程、真菌防御、中性粒细胞浸润、谷胱甘肽代谢过程、趋化因子的产生等生物学过程;其中表达下调基因主要富集于谷胱甘肽衍生物的生物合成过程和细胞外基质成分。蛋白互作网络分析发现差异基因表达蛋白的三个核心结点HPGDS、S100AB和KRT16。在创面的愈合过程Hpgds在糖尿病创面中的表达均低于正常小鼠。采用HpgdssiRNA在正常小鼠创面局部敲低Hpgds的表达会显著影响创面的愈合。证明糖尿病创面中Hpgds表达下调是阻碍其愈合的关键因素。
糖尿病小鼠在创面形成8h时与免疫相关通路的活化较少，而在10d和14d时，糖尿病小鼠创面中与免疫相关通路的活性较正常小鼠增强。在创面形成第8h时，正常小鼠创面中重要免疫相关基因的表达较糖尿病小鼠高，而在10d和14d时其表达较糖尿病小鼠低。糖尿病小鼠和正常小鼠皮肤创面中主要免疫细胞组分是巨噬细胞、单核细胞、CD4T细胞和CD8T细胞。在创面愈合的两天内，糖尿病小鼠创面中单核细胞、M1巨噬细胞和中性粒细胞的比例较正常小鼠低;但是在创面愈合的后期(6-14d)，单核细胞、M1巨噬细胞、中性粒细胞、CD8T细胞和NK细胞比例一直高于正常小鼠。
2.过表达Hpgds对hADSC生物学特性的影响
方法:利用慢病毒将小鼠Hpgds基因整合到hADSCs细胞中;采用实时定量PCR检测hADSCHpgds的过表达效率，利用ELISA试剂盒检测hADSCHpgds体外培养上清中PGD2表达量;利用流式细胞学技术分析hADSCHpgds的表面干细胞标志物(CD44、CD73、CD90、CD105);采用CCK8细胞增殖实验、划线法和AnnexinⅤ细胞凋亡实验分别检测hADSCHpgds的增殖、迁移和凋亡能力;将hADSCHpgds向成脂和成骨细胞方向诱导分化，分别在诱导第7和第14天，采用油红O染色和茜素红染色镜下观察成脂和成骨分化的结合;同时提取诱导分化后细胞的总NRA，采用实时定量PCR检测成脂标志基因PPARγ和成骨标志基因RUNX2的表达量。
结果:Hpgds在ADSCHpgds中的表达显著升高，且在其培养上清中PGD2的含量也显著升高。ADSCs过表达Hpgds后对其干细胞标志物(CD44、CD73、CD90、CD105)的表达无显著影响。ADSCs过表达Hpgds后对ADSCs的增殖、迁移、分化和凋亡特性没有显著影响。
3.RGD-VitroGel3D水凝胶装载hADSCHgds在糖尿病小鼠创面中的应用及其作用机制
方法:首先检测hADSCHpgds与RGD修饰的VitroGel3D水凝胶的生物相容性;用CM-dil标记hADSCHpgds，采用IVIS成像系统检测移植细胞在小鼠活体内的转归;然后用RGD-VitroGel3D水凝胶装载hADSCHpgds和hADSCPCDH，用于糖尿病小鼠创面的治疗;采用免疫荧光染色和免疫组化的方法，检测糖尿病小鼠创面组织中的PCNA、CD31、CollagenⅠ的表达，同时用时定量PCR检测组织中VEGF和CollagenⅠ基因的表达水平，来分析hADSCHpgds对糖尿病小鼠创面修复的促进作用;为检测hADSCHpgds对糖尿病创面的免疫调节作用，采用免疫染色法检测创面组织中中性粒细胞(Ly-6g)，CD8T细胞和巨噬细胞浸润程度，同时用时定量PCR检测组织中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α和iNOS的表达;为明确导致hADSCHpgds和hADSC治疗效果差异的原因，在体外实验中检测hADSCHpgds的条件培养基对经LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞的调节作用;对比hADSCHpgds与hADSCPCDH，其差异之处在于Hpgds的催化产物为PGD2，因此在经过LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞培养基中添加PGD2，检测其对炎性巨噬细胞CD206、VEGF、以及炎性基因IL-1β、IL-6、TNF-α表达的影响。
结果:镜下观察到水凝胶中的绿色荧光面积不断增多，表明hADSCHpgds和hADSCPCDH在水凝胶中增殖状态良好，细胞和支架具有较好的生物相容性。采用IVIS成像系统检测活体小鼠的生物荧光信号，实验结果发现荧光区域局限在创面部位，移植后5天内，创面荧光值逐渐增高，表明移植细胞在创面处于增殖状态;第16天时创面中荧光信号完全消失，表明移植的hADSCHpgds在创面环境中的作用时间可达16天，且无远处转移。创面愈合2月后在创缘3mm内取材，解剖心、肝、脾、肺、肾组织进行组织学评价，未见移植hADSCHpgds引起组织形态结构的明显变化。control组(PBS)、hADSCPCDH和hADSCHpgds组在移植后的第17天，hADSCHpgds组糖尿病小鼠创面的愈合速度显著快于control组和hADSCPCDH组。移植后第10天，hADSCHpgds组PCNA荧光信号面积大于control组和hADSCPCDH组;第13天时，创缘组织免疫组织化学染色发现hADSCHpgds组CD31和CollagenⅠ细胞阳性率高于Control组和hADSCPCDH，同时时定量PCR检测hADSCHpgds组创面组织中VEGF和Col-Ⅰ的表达显著高于Control组和hADSCPCDH组。糖尿病小鼠创面第7天创面组织免疫组化染色发现hADSCHpgds组中性粒细胞和CD8T细胞阳性率显著低于Control组和hADSCPCDH组，免疫荧光染色结果显示，hADSCHpgdsF4/80+CD206+细胞阳性率高于Control组和hADSCPCDH组。体外实验中，hADSCHpgds和hADSCPCDH的条件培养基培养经LPS诱导过的RAW264.7巨噬细胞。研究结果显示，hADSCHpgds组巨噬细胞CD206和VEGF的表达量较ADSCPCDH和PBS组升高，同时IL-1β、IL-6、TNF-α的表达显著降低;在经LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞培养基中添加PGD2与，实验结果与hADSCHpgds的条件培养基一致。
研究结论
1.HPGDS表达下调可能导致糖尿病创面中的免疫反应激活延迟，促炎细胞持续活化以及促炎因子大量累积，最终导致糖尿病创面的延迟愈合;
2.过表达Hpgds对hADSC的干细胞标志物、增殖、迁移、凋亡和分化均无显著性影响;
3.RGD修饰的VitroGel3D水凝胶装载的hADSCHpgds能有效的促进糖尿病小鼠创面的愈合，抑制创面中中性粒细胞和CD8T细胞的浸润，减少促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α和iNOS的表达，促进创面中M2修复型巨噬细胞的极化。
糖尿病皮肤溃疡(diabetic cutaneous ulcers，DCU)是指糖尿病患者由于长期血糖控制不良，进而引起神经病变及不同程度的各种末梢血管病变而导致下肢感染、溃疡形成和深部组织的破坏[1,2]。DCU患者创面迁延不愈，反复的感染，需要长期的伤口护理，严重的致死致残，这些都严重影响患者的正常生活，也给社会带来巨大经济负担[3,4]，因此对糖尿病皮肤溃疡治疗的研究具有重要的临床应用价值。目前的治疗方法仍以手术治疗为主，已有的生物和物理的治疗方法都存在诸多局限性，未能达到满意的治疗效果。
前期研究发现造血前列腺素D合成酶(hematopoietic prostaglandin D synthase，HPGDS)在糖尿病创面中的表达下调。HPGDS主要表达于造血细胞系细胞，如肥大细胞和Th2细胞，其主要作用是催化免疫系统中前列腺素D2(prostaglandin D2，PGD2)的生成。PGD2通过过氧化物酶体增殖物激活受体γ的激活来调节炎症反应[5]，能够抑制iNOS，TNF-α和IL-1β以及巨噬细胞的浸润，还能调节小鼠T细胞和B细胞的凋亡来减轻炎症反应[6,7]。因此推测HPGDS表达下调阻碍了糖尿病溃疡组织中炎症反应的消退，炎症微环境的紊乱抑制了溃疡的修复。因此调控糖尿病溃疡组织中HPGDS的表达可能成为促进其修复的新靶点。
为了提高脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSC)在糖尿病溃疡中的治疗效果，以ADSC为载体过表达HPGDS，有针对性的增强ADSC在糖尿病溃疡中的免疫调节功能。由于糖尿病慢性溃疡处组织缺损、缺乏血供、炎症反应剧烈，导致移植成活率较低，从而限制了脂肪间充质干细胞的临床应用。本研究采用的RGD肽修饰的VitroGel3D水凝胶支架可以通过物理分离保护自身免受宿主免疫系统的侵害[8]，从而为移植ADSCHPGDs的粘附和生存提供适当的理化微环境，优化糖尿病创面中干细胞移植治疗的效果。基因和细胞疗法的结合将改善糖尿病创面的免疫和再生的微环境，加速慢性创面的愈合。本研究可为皮肤组织工程种子细胞的改进提供重要的理论基础，也为糖尿病慢性溃疡的创面免疫调节提供了重要的临床应用前景。
研究目的
1.通过生物信息学分析寻找糖尿病创面组织中发生改变的关键分子，明确糖尿病创面免疫微环境的特征;
2.探索过表达Hpgds对hADSC生物学特性(干细胞标志、增殖、迁移、分化、凋亡)的影响;
3.探讨hADSCHpgds复合RGD肽修饰的VitroGel3D水凝胶支架在糖尿病小鼠创面愈合中的作用及其机制。
研究方法和结果
1.糖尿病创面生物信息学分析及其免疫微环境特征
方法:从NCBIGEODatasets中获取人正常皮肤组织和糖尿病溃疡组织的高通量芯片数据，对其进行基因本体(Gene Ontology，GO)分析、蛋白互作网络分析，筛选关键信号分子;通过Real-timePCR对比检测正常小鼠和糖尿病小鼠创面愈合过程中Hpgds的动态表达差异;利用HpgdssiRNA在正常小鼠创面中敲低Hpgds，与PBS组和controlsiRNA组对比，观察Hpgds敲低后对正常小鼠创面愈合的影响;在0h、8h、2d、6d、10d、14d时取材提取组织总RNA，采用RNA-seq和ImmuCC计算模型检测糖尿病小鼠创面中免疫相关通路的活性，对比糖尿病小鼠和正常小鼠炎症因子和免疫细胞组分的动态变化。
结果:筛选到糖尿病皮肤细胞表达上调基因21个，表达下调的基因22个。GO分析结果显示糖尿病溃疡组织的差异基因主要富集于角质细胞分化、角质化、肽交联、表皮发育、中间纤维细胞骨架组织、谷胱甘肽衍生物的生物合成过程、真菌防御、中性粒细胞浸润、谷胱甘肽代谢过程、趋化因子的产生等生物学过程;其中表达下调基因主要富集于谷胱甘肽衍生物的生物合成过程和细胞外基质成分。蛋白互作网络分析发现差异基因表达蛋白的三个核心结点HPGDS、S100AB和KRT16。在创面的愈合过程Hpgds在糖尿病创面中的表达均低于正常小鼠。采用HpgdssiRNA在正常小鼠创面局部敲低Hpgds的表达会显著影响创面的愈合。证明糖尿病创面中Hpgds表达下调是阻碍其愈合的关键因素。
糖尿病小鼠在创面形成8h时与免疫相关通路的活化较少，而在10d和14d时，糖尿病小鼠创面中与免疫相关通路的活性较正常小鼠增强。在创面形成第8h时，正常小鼠创面中重要免疫相关基因的表达较糖尿病小鼠高，而在10d和14d时其表达较糖尿病小鼠低。糖尿病小鼠和正常小鼠皮肤创面中主要免疫细胞组分是巨噬细胞、单核细胞、CD4T细胞和CD8T细胞。在创面愈合的两天内，糖尿病小鼠创面中单核细胞、M1巨噬细胞和中性粒细胞的比例较正常小鼠低;但是在创面愈合的后期(6-14d)，单核细胞、M1巨噬细胞、中性粒细胞、CD8T细胞和NK细胞比例一直高于正常小鼠。
2.过表达Hpgds对hADSC生物学特性的影响
方法:利用慢病毒将小鼠Hpgds基因整合到hADSCs细胞中;采用实时定量PCR检测hADSCHpgds的过表达效率，利用ELISA试剂盒检测hADSCHpgds体外培养上清中PGD2表达量;利用流式细胞学技术分析hADSCHpgds的表面干细胞标志物(CD44、CD73、CD90、CD105);采用CCK8细胞增殖实验、划线法和AnnexinⅤ细胞凋亡实验分别检测hADSCHpgds的增殖、迁移和凋亡能力;将hADSCHpgds向成脂和成骨细胞方向诱导分化，分别在诱导第7和第14天，采用油红O染色和茜素红染色镜下观察成脂和成骨分化的结合;同时提取诱导分化后细胞的总NRA，采用实时定量PCR检测成脂标志基因PPARγ和成骨标志基因RUNX2的表达量。
结果:Hpgds在ADSCHpgds中的表达显著升高，且在其培养上清中PGD2的含量也显著升高。ADSCs过表达Hpgds后对其干细胞标志物(CD44、CD73、CD90、CD105)的表达无显著影响。ADSCs过表达Hpgds后对ADSCs的增殖、迁移、分化和凋亡特性没有显著影响。
3.RGD-VitroGel3D水凝胶装载hADSCHgds在糖尿病小鼠创面中的应用及其作用机制
方法:首先检测hADSCHpgds与RGD修饰的VitroGel3D水凝胶的生物相容性;用CM-dil标记hADSCHpgds，采用IVIS成像系统检测移植细胞在小鼠活体内的转归;然后用RGD-VitroGel3D水凝胶装载hADSCHpgds和hADSCPCDH，用于糖尿病小鼠创面的治疗;采用免疫荧光染色和免疫组化的方法，检测糖尿病小鼠创面组织中的PCNA、CD31、CollagenⅠ的表达，同时用时定量PCR检测组织中VEGF和CollagenⅠ基因的表达水平，来分析hADSCHpgds对糖尿病小鼠创面修复的促进作用;为检测hADSCHpgds对糖尿病创面的免疫调节作用，采用免疫染色法检测创面组织中中性粒细胞(Ly-6g)，CD8T细胞和巨噬细胞浸润程度，同时用时定量PCR检测组织中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α和iNOS的表达;为明确导致hADSCHpgds和hADSC治疗效果差异的原因，在体外实验中检测hADSCHpgds的条件培养基对经LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞的调节作用;对比hADSCHpgds与hADSCPCDH，其差异之处在于Hpgds的催化产物为PGD2，因此在经过LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞培养基中添加PGD2，检测其对炎性巨噬细胞CD206、VEGF、以及炎性基因IL-1β、IL-6、TNF-α表达的影响。
结果:镜下观察到水凝胶中的绿色荧光面积不断增多，表明hADSCHpgds和hADSCPCDH在水凝胶中增殖状态良好，细胞和支架具有较好的生物相容性。采用IVIS成像系统检测活体小鼠的生物荧光信号，实验结果发现荧光区域局限在创面部位，移植后5天内，创面荧光值逐渐增高，表明移植细胞在创面处于增殖状态;第16天时创面中荧光信号完全消失，表明移植的hADSCHpgds在创面环境中的作用时间可达16天，且无远处转移。创面愈合2月后在创缘3mm内取材，解剖心、肝、脾、肺、肾组织进行组织学评价，未见移植hADSCHpgds引起组织形态结构的明显变化。control组(PBS)、hADSCPCDH和hADSCHpgds组在移植后的第17天，hADSCHpgds组糖尿病小鼠创面的愈合速度显著快于control组和hADSCPCDH组。移植后第10天，hADSCHpgds组PCNA荧光信号面积大于control组和hADSCPCDH组;第13天时，创缘组织免疫组织化学染色发现hADSCHpgds组CD31和CollagenⅠ细胞阳性率高于Control组和hADSCPCDH，同时时定量PCR检测hADSCHpgds组创面组织中VEGF和Col-Ⅰ的表达显著高于Control组和hADSCPCDH组。糖尿病小鼠创面第7天创面组织免疫组化染色发现hADSCHpgds组中性粒细胞和CD8T细胞阳性率显著低于Control组和hADSCPCDH组，免疫荧光染色结果显示，hADSCHpgdsF4/80+CD206+细胞阳性率高于Control组和hADSCPCDH组。体外实验中，hADSCHpgds和hADSCPCDH的条件培养基培养经LPS诱导过的RAW264.7巨噬细胞。研究结果显示，hADSCHpgds组巨噬细胞CD206和VEGF的表达量较ADSCPCDH和PBS组升高，同时IL-1β、IL-6、TNF-α的表达显著降低;在经LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞培养基中添加PGD2与，实验结果与hADSCHpgds的条件培养基一致。
研究结论
1.HPGDS表达下调可能导致糖尿病创面中的免疫反应激活延迟，促炎细胞持续活化以及促炎因子大量累积，最终导致糖尿病创面的延迟愈合;
2.过表达Hpgds对hADSC的干细胞标志物、增殖、迁移、凋亡和分化均无显著性影响;
3.RGD修饰的VitroGel3D水凝胶装载的hADSCHpgds能有效的促进糖尿病小鼠创面的愈合，抑制创面中中性粒细胞和CD8T细胞的浸润，减少促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α和iNOS的表达，促进创面中M2修复型巨噬细胞的极化。