论文部分内容阅读
蛋白酶体系统是真核生物中主要的蛋白质降解系统，并影响着多种细胞过程，如细胞信号转导、细胞死亡和免疫应答。截至目前为止，已有三种不同类型的蛋白酶体激活因子被发现和研究，包括PA700、PA28/PA26和PA200。其中，PA700（也称19S调节颗粒）是一种ATP依赖的激活因子，它能与20S蛋白酶体形成26S蛋白酶体全酶从而介导泛素依赖的蛋白质降解。与之相反，PA28/PA26这类激活因子（在大多数物种中称为PA28或者11S调节颗粒或者REG，在锥虫中称为PA26）能以非ATP和非泛素依赖的方式介导多肽和蛋白质的降解。已有研究表明PA28αβ能参与负责MHCⅠ类复合体(MHC classⅠcomplex)配体的产生，而PA28γ能激活20S蛋白酶体降解细胞周期依赖性激酶抑制蛋白，如p21、p16和p14。由于PA28-20S蛋白酶体的动态性和异质性，其完整结构尚未得到解析，因此PA28-20S蛋白酶体激活和降解底物的分子机制仍知之甚少。 在本研究中，我们利用冷冻电镜单颗粒重构技术首次解析了PA28αβ-iCP（PA28αβ-immunoproteasome，PA28αβ-iCP）、PA28γ和PA28γ-20S的近原子分辨率的三维结构，分辨率分别达到4.3(A)、3.6(A)和3.8(A)。PA28γ同源七聚体的整体结构与PA28αβ异源七聚体的结构高度相似。我们的结构和质谱数据揭示了PA28αβ和iCP之间的空间排列方式及其相互作用。值得注意的是，来自PA28αβ和PA28γ的C-末端占据了20S蛋白酶体的不同口袋，表明它们对20S蛋白酶体的不同口袋的特异性。然而，这两种PA28-20S复合体的20S蛋白酶体门控都是闭合的，这与PA26-20S的情况不同。鉴于这两个PA28-20S复合体对荧光肽底物Suc-LLVY-AMC或Suc-LLR-AMC表现出很高的蛋白水解活性，PA28的C-末端插入20S颗粒的口袋可能不足以导致真核细胞20S蛋白酶体的门控打开。总之，我们的发现为PA28-20S复合体的20S蛋白酶体门控打开和激活机制的研究提供了新见解，将有助于发展针对PA28-20S的特异性抑制剂和相关疾病的诊疗。 手足口病(Hand，food，and mouth disease，HFMD)是世界范围内常见的传染病。在中国，手足口病每年导致数以百万计的临床病例和数百人死亡。手足口病可由多种肠道病毒引起，包括肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A16型(CVA16)、A6型(CVA6)和A10型(CVA10)。其中，EV71和CVA16在过去十年中一直是主要的病原体，并且对其研究较为深入。但近年来CVA6和CVA10也已经成为手足口病的主要致病因子。然而，现有的商业化手足口病疫苗仅针对EV71，但不能预防CVA16、CVA6或CVA10感染。此外，至今尚无CVA6和CVA10成熟病毒颗粒的结构，因此无法为针对CVA6和CVA10的疫苗和抗病毒药物的开发提供结构基础。 CVA6病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)此前被证明是一种具有发展前景的CVA6疫苗候选株。在本研究中，我们解析了首个CVA6VLP的3.0(A)的冷冻电镜结构，表明它是一种膨胀的颗粒，整体结构与EV71VLP和CVA16135S颗粒相似。然而，在这3种颗粒的结构蛋白的表面loop和C末端上具有重要的结构区别，而这些区域通常也是肠道病毒的抗原位点。通过免疫学的手段，我们的合作者上海巴斯德所黄忠研究组鉴定了两个CVA6特异性的B-细胞线性表位，分别位于VP1的GH loop和C末端。我们的研究阐明了CVA6VLP作为一种理想的候选疫苗的结构基础与重要的抗原位点，同时也为肠道病毒原体组装提供了结构信息。 在本研究中，我们还首次解析了CVA10的成熟病毒颗粒与原生空心颗粒的冷冻电镜结构，分辨率分别达到2.84(A)和3.12(A)。CVA10成熟病毒颗粒的整体结构与EV71和CVA16成熟病毒颗粒类似，但是结构对比表明这些颗粒的表面的loop区域有明显区别，而这些区域通常是主要的受体结合位点与抗原位点。在CVA10成熟病毒颗粒的VP1pocket中具有一个pocket factor，并且与EV71成熟病毒中的pocket factor高度相似。另外，我们的研究从结构上解释了Pleconaril，WIN51711和Pirodavir不能抑制CVA10感染的原因。综上，我们的研究对于CVA10的疫苗与抗病毒药物的研发有重要的意义。