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红掌是具有重要观赏价值和经济价值的花卉,具有广阔的市场前景。单倍体育种是快速培养植物新品种的有效方法之一。但目前国内外均未见到红掌单倍体育种的研究报道。本研究在弄清红掌小孢子形成和发育时期及其与花序形态特征关系的基础上,研究了发育时期、基因型、培养基、低温预处理和预培养对红掌花药和子房培养的影响、探讨了再生植株的鉴定方法,旨在建立红掌单倍体离体诱导技术体系。得到以下研究结果:
1.SweetDream小孢子形成和发育过程是一个连续的过程,可分为小孢子母细胞形成期、小孢子母细胞减数分裂期、小孢子早期、小孢子中期、小孢子晚期、二胞花粉期和成熟花粉期。
2.SweetDream小孢子发育时期可根据花序外观特征及柱头发育状况来判断,而与花序长度没有必然的关系。四分体期,苞片未展,小花呈淡红色;小孢子期,苞片即将展开或完全展开,柱头未突出;二胞花粉期,柱头伸出,小花呈暗紫红色。
3.无菌花药获得率因品种不同而有显著差异。JungleBush的无菌花药获得率最高,为72.61%,Mylene次之,其余品种低于50%。同一个品种,无菌花药和子房的获得率无明显差异。取材时间对无菌花药和子房获得率有明显影响,取材的最适时间是在10月份到次年的2月份。
4.小孢子中晚期是红掌花药培养的适宜时期。基因型对花药膨大率有显著的影响。不同培养基对SweetDream和JungleBush的花药培养效果有显著影响。在1/2N6+肌醇100mg·L-1+BA0.5mg·L-1+2,4-D2.0mg·L-1+生物素1.0mg·L-1+CW15%+Su3%+Glu2%的培养基上,SweetDream的诱导率为1.67%。低温预处理明显提高SweetDream的花药膨大率。预培养明显提高SweetDream、JungleBush和PinkChampion的四分体期至小孢子期的花药膨大率。预培养后,JungleBush的小孢子中晚期的花药在1/2N6+肌醇100mg·L-1+BA0.5mg·L-1+2,4-D1.0mg·L-1+生物素1.0mg·L-1+CW15%+Su3%+Glu2%培养基上的诱导率为0.56%。在培养基1/2MS+BA1.0mg·L-1+IBA1.0mg·L-1+CW10%+Su3%上,SweetDream的花药愈伤组织增殖和芽分化较快。致密花药愈伤组织获得的小苗生根率为95.00%。疏松花药愈伤组织获得的小苗生根困难,生根率为30.00%。
5.SweetDream的花药再生植株与叶片再生植株在形态特征上有差异。但经染色体鉴定的40株花药再生植株均是二倍体(2n=30)。RAPD分析显示致密愈伤获得的植株与叶片再生植株在带型上有差异。
6.小孢子期对应的子房适宜用于培养。基因型和培养基对子房培养有显著影响。在1/2MS+BA1.0mg·L-1+NAA0.5mg·L-1+生物素1.0mg·L-1+CW5%+Su3%培养基上,RedAngel和BB掌的诱导率分别为0.08%和1.20%。在1/2N6+肌醇100mg·L-1+BA1.0mg·L-1+2,4-D0.5mg·L-1+NAA0.2mg·L-1+生物素1.0mg·L-1+CW15%+Su3%+Glu2%和1/2MS+BA1.0mg·L-1+IBA1.0mg·L-1+CW10%+Su3%培养基上,Mylene的诱导率分别为0.04%和2.00%。低温预处理明显提高SweetDream的子房膨大率。预培养明显提高SweetDream、JungleBush和PinkChampion的四分体期至小孢子期对应子房的膨大率。在1/2N6+肌醇100mg·L-1+BA1.0mg·L-1+KT3.0mg·L-1+NAA0.5mg·L-1+CW10%+Su2%+Glu2%培养基上,预培养后的JungleBush小孢子期对应的子房可形成愈伤组织,诱导率为0.56%。
通过上述的研究,初步建立了红掌花药和子房离体培养技术体系,为开展红掌单倍体育种奠定了基础。