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乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)慢性感染是肝细胞肝癌(hepatocelluarcarcinoma,HCC)发病的重要原因之一。乙肝病毒X蛋白(hepatitis B virus Xprotein，HBx)是乙肝病毒x基因的表达产物，具有反式激活作用，可通过多种机制导致HCC的发生，但其致癌的分子机制尚不清楚。MicroRNAs(miRNAs)是一类长度在19-24个核苷酸（nt)的内源性非编码单链小分子RNA。近年来研究发现，miRNAs在肿瘤的发生发展中具有重要的作用，可作为癌基因或抑癌基因促进或抑制肿瘤的发生。为了进一步阐明HBx致癌的分子机制，本论文从以下三个方面进行了深入研究。
第一部分：micrRNA-520b在HBx促进肝癌细胞生长作用中的研究
本实验室前期研究发现，HBx与survivin协同可下调mieroRNA-520b(miR-520b)的表达水平。在此基础上，本文应用报告基因方法，在稳定表达HBx和survivin的L-O2细胞系中发现miR-520b的启动子活性受到抑制，且与SP-1转录因子有关。然后，利用实时定量PCR(qRT-PCR)方法发现，miR-520b在11例临床肝癌标本中和4个肝癌细胞系(HepG2，H7402，MHCC-97L，MHCC-97H)中均呈低表达。应用克隆形成实验、EdU增殖实验和MTT实验检测结果显示，miR-520b可以在体外抑制肝癌HepG2/H7402细胞的增殖。通过生物信息学分析发现，cyclin DI和MEKK2是miR-520b的两个潜在的靶基因。利用报告基因和免疫印迹实验检测发现，miR-520b可以直接靶向cyelin D1和MEKK2的3UTR区域，并抑制其翻译。EdU增殖实验和MTT实验检测结果显示，cyclin D1和MEKK2具有促进肝癌HepG2/H7402细胞增殖的作用。此外，裸鼠成瘤实验结果显示，miR-520b在体内具有抑制肝癌HepG2细胞生长的作用。上述结果表明，miR-520b可以通过靶向cyclin D1和MEKK2发挥抑制肝癌细胞生长的作用，提示miR-520b可能是一个抑癌的miRNA。miR-520b在肝癌的诊断和治疗中具有应用价值。
第二部分：microRNA-29a在HBx促进肝癌细胞迁移作用中的研究
本研究利用qRT-PCR方法发现， microRNA-29a(miR-29a)在p21-HBx转基因鼠肝组织、稳定表达HBx的肝癌细胞系HepG2/H7402和整合HBV全基因组的HepG2.2.15细胞中均呈上调表达。应用RNA干扰沉默HBx mRNA，结果显示miR-29a的表示水平与HBx有关。此外，miR-29a在具有高转移倾向的肝癌细胞系MHCC-97H中也上调表达，提示miR-29a的功能与肝癌细胞的迁移能力有关。应用细胞伤口愈合实验和Boydens chamber实验发现，在肝癌HepG2细胞中过表达miR-29a，可显著增强肝癌细胞的迁移能力，而miR-29a抑制剂可以废除HBx对肝癌HepG2细胞迁移的促进作用。利用生物信息学方法显示，PTEN是miR-29a的潜在靶基因。报告基因检测结果表明，miR-29a可以直接靶向PTEN的3uTR区域。RT-PCR和免疫印迹实验结果显示，在肝癌HepG2和MHCC-97L细胞中miR-29a可以显著抑制PTENrnRNA和蛋白的表达水平，进一步证明PTEN是miR-29a直接的靶基因。为了进一步探讨PTEN是否参与miR-29a对细胞迁移的促进作用，我们在过表达miR-29a的肝癌HepG2细胞中过表达PTEN，发现PTEN可明显阻断miR-29a的促迁移作用。Akt是已报道的PTEN下游的靶分子，为了验证miR-29a对PTEN的调节作用，进一步检测了miR-29a对Akt磷酸化水平的影响。结果显示，miR-29a可显著增强Akt的磷酸化水平，为证明miR-29a靶向PTEN发挥功能提供了新的实验依据。
第三部分：MEKK2在HBx促进肝癌细胞增殖作用中的研究
本实验室前期应用基因芯片检测HBx致癌过程中的基因表达谱变化，结果显示MEKK2呈上调表达，提示MEKK2在HBx致癌过程中发挥作用。为了进一步丰富HBx促进肝癌细胞增殖的作用及其分子机制，本文探讨了MEKK2是否参与HBx的促肝癌细胞增殖作用。应用RT-PCR和免疫印迹检测，结果证实在肝癌HepG2/H7402细胞中HBx可以在mRNA和蛋白两个水平上调MEKK2的表达。报告基因结果显示，在肝癌HepG2/H7402细胞中HBx可以上调MEKK2的启动子活性，显示HBx可以在转录水平激活MEKK2的表达。此外，报告基因检测结果显示，与对照组相比，在HepG2.2.15细胞中MEKK2的启动予活证明显增强。AP-1和JNK是MEKK2的两个下游效应因子，为了进一步验证HBx对MEKK2的调节作用，应用RNA干扰沉默HBx或MEKK2后，结果显示AP-1和JNK的激活受到抑制，为HBx上调MEKK2的作用提供了实验依据。EdU增殖实验和MTT实验检测结果显示，在稳定转染HBx的肝癌HepG-X细胞和HepG2.2.15细胞中干扰MEKK2的表达后，可显著抑制肝癌细胞的增殖，提示MEKK2参与了HBx对肝癌细胞增殖的促进作用。实时定量PCR和免疫印迹结果显示，HBx和MEKK2在11例临床肝癌标本中均呈高表达，提示HBx与MEKK2的表达呈正相关关系。组织芯片结果显示，MEKK2在95例临床肝癌标本中的阳性率为85.3％，揭示MEKK2在肝癌的发生发展中具有重要的作用。
综上所述，本研究为揭示miRNAs在HBx致癌过程中的作用及其分子机制提供了新的实验依据，进一步丰富了HBx促进肝癌细胞增殖和迁移的的分子机理研究，对于肝癌的诊断、预防及治疗具有重要的理论价值。