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研究背景与目的：近年来细胞遗传学的研究发现，在人类头颈、食管、乳腺、肺、胃肠、卵巢、前列腺、和膀胱等众多恶性上皮性肿瘤中存在染色体3q或3q部分区段的高频扩增。提示在染色体3q的某些DNA扩增区存在一个或多个关键的癌基因，其扩增与表达异常可能在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。2001年，Guan等应用染色体微切割及筛选杂交技术，从卵巢癌细胞的3q26.2高扩增区段克隆了一个新的候选癌基因—eIF—5A2。由于该基因编码的蛋白与真核翻译起始因子EIF—5A有82％的同源性，所以该基因被命名为eIF—5A2。以往的研究表明，eIF—5A基因在细胞生长和增殖中具有重要的作用；在HeLa细胞和中国仓鼠卵巢上皮细胞中，当EIF—5A蛋白被抑制时，其细胞生长与增殖受到明显抑制，而且可以引发细胞的凋亡。我们在卵巢癌的前期体内外研究中发现，eIF—5A2基因在肿瘤的发生发展过程中起重要的癌基因作用；EIF—5A2蛋白的过度表达与卵巢癌的恶性进展有明显的相关性。由于结直肠癌和膀胱癌等许多恶性上皮肿瘤中也存在3q或3q部分区段的高频扩增，那么在结直肠癌和膀胱癌等恶性肿瘤中是否也存在着eIF—5A2基因的扩增与异常表达？其是否与肿瘤的恶性进展密切相关？能否成为评估肿瘤预后的新分子标记物？等等，目前国内外尚未见文献报道。因此，本课题旨在探索eIF—5A2基因在结直肠癌、膀胱癌和卵巢癌中的扩增与表达情况及其临床病理学意义；同时探讨其在结直肠癌细胞中的癌基因作用。
材料和方法：
1.病例收集：收集中山大学附属肿瘤医院、中山大学附属第一医院和广东省人民人医院1990年到2005年间的结直肠肿瘤、卵巢肿瘤和膀胱癌患者手术切除的石腊包埋组织标本及其相关的临床病理学资料。在本研究选取的结直肠癌病例中，包括139例进行局部结直肠癌切除术的肿瘤组织和相应的癌旁正常粘膜组织；同时，收集了22例伴发的结直肠腺瘤的标本和42例结直肠癌转移病灶标本。在选取的170例卵巢肿瘤病例中，包括有30例良性腺瘤、30例交界性肿瘤和110例恶性肿瘤；同时选取30例卵巢正常组织作为对照。在膀胱癌病例的挑选中，选取了两组接受不同治疗方法的膀胱癌病例，一组为90例浸润型膀胱癌和50例癌旁的正常膀胱粘膜组织，另一组为112例浅表性膀胱癌和30例相应的癌旁正常膀胱粘膜组织。另外，我们同时也收集了13对新鲜的浅表性(pTa/pT1)膀胱癌组织及其癌旁的正常粘膜组织。
2.方法：本研究中我们在构建组织芯片的基础上，应用免疫组化、RT—PCR、蛋白印迹和荧光原位杂交的方法，检测eIF—5A2基因在结直肠癌、卵巢癌和膀胱癌中的表达与扩增，并结合肿瘤的临床病理学和预后资料，分析它们之间的相关性。在eIF—5A2基因功能的体外研究中，我们设计并构建RNA干扰的体外表达质粒，转染进入结直肠癌SW480细胞中并筛选稳定表达的克隆。应用RT—PCR和蛋白印迹方法检测mRNA和蛋白的表达，并利用MTT、Transwell侵袭小室和平板克隆等实验方法研究细胞的增殖和体外侵袭浸润的能力。
结果：
Ⅰ．eIF—5A2基因在结直肠癌、卵巢癌和膀胱癌中的表达与扩增及其临床意义
1.结直肠癌：免疫组化结果显示，分别有35.3％的结直肠腺瘤，53.2％的原发性结直肠癌和67.6％的转移性癌组织出现EIF—5A2蛋白的过度表达；而全部的癌旁正常肠粘膜组织未发现EIF—5A2蛋白的过度表达。在本组结直肠癌中，EIF—5A2蛋白表达与肿瘤的淋巴血管浸润，局部淋巴结转移，以及远处转移均有显著的相关性(P<0.05)。在伴随淋巴血管浸润的病例中，有61.2％的肿瘤存在EIF—5A2过度表达，明显高于无淋巴血管浸润的肿瘤(36.6％)；而在伴有局部淋巴结转移(pTN1-2)和远处转移(pM1)的病例中，分别有63.8％和74.2％的肿瘤出现EIF—5A2过度表达，其过度表达率也明显高于无淋巴结转移组(40.4％)和无远处转移组(46.3％)。另外，EIF—5A2的过度表达与肿瘤细胞的增殖(Ki—67)显著正相关(P<0.05)。本组FISH检测结果发现，在97例成功进行检测和分析的结直肠癌病例中，有15例检测到eIF—5A2基因的扩增，其中13例存在EIF—5A2蛋白的过度表达。
2.卵巢癌：免疫组化结果发现，分别有6.7％的卵巢腺瘤，30.0％的卵巢交界性肿瘤，和52.7％的卵巢癌组织中出现EIF—5A2过度表达；而所有正常卵巢癌上皮组织则未发现该蛋白过度表达。相关性分析发现，本组卵巢癌组织中EIF—5A2蛋白表达与肿瘤的组织学类型、pT分期、pN分期，FIGO分期、以及细胞增殖(Ki—67)均有显著的相关性(P<0.05)。进一步，我们对EIF—5A2表达与患者预后进行了单因素生存分析，结果发现EIF—5A2过度表达组患者的平均生存时间(39.0月)明显短于正常表达组(69.5月，P<0.001)。多变量的Cox回归分析发现，EIF—5A2蛋白表达是判断本组患者总生存率的独立预后指标(P=0.043)。FISH检测发现，本组卵巢癌中有15.9％(10/63)的病例存在eIF—5A2基因扩增，而且全部10例均存在EIF—5A2蛋白过度表达。
3.膀胱癌(浸润性膀胱癌)：在免疫组化和FISH检测有效的膀胱癌中，分别有45.3％(39/86)和10.6％(5/47)的病例存在EIF—5A2蛋白过度表达和基因扩增。相关性分析发现，本组膀胱癌中EIF—5A2表达与患者的临床病理特征(患者年龄、性别、肿瘤分期、肿瘤分级)均无明显相关性，但与肿瘤细胞的增殖则有显著的相关性(P=0.007)。对EIF—5A2表达与膀胱癌患者的预后进行单因素生存分析，结果发现蛋白过度表达患者的平均生存时间(38.2月)显著短于正常表达的患者(52.9月，P＝0.001)。多变量的Cox回归分析结果显示，EIF—5A2蛋白表达(P=0.004)与肿瘤pT分期(P=0.005)均是评估患者总生存率的独立预后指标。进一步，我们对不同分级和临床分期的肿瘤进行了分层预后分析，结果显示：EIF—5A2蛋白过度表达在G1/G2级(P=0.0009)，G3级(P=0.016)，pT1(P=0.0089)、pT2(P=0.0354)、pT3/4(P=0.0058)、pN0(P=0.0039)、和pN1-2期(P=0.0093)的肿瘤中，均是评估肿瘤预后的有效指标。
4.膀胱癌(浅表性膀胱癌)：免疫组化结果显示，在112例浅表性膀胱癌(pTa/pT1)病例中，有38例(33.9％)检测到EIF—5A2的过度表达。相关性分析发现，本组膀胱癌中EIF—5A2表达与患者的年龄、性别、肿瘤分期、肿瘤分级等临床病理特征均无明显相关性。单因素生存分析发现，EIF—5A2蛋白过度表达患者的术后无复发生存时间(22.2月)和术后无进展生存时间(36.2月)均明显短于正常表达组患者(31.6月，P=0.002和40.7月，P=0.004)。进一步多变量的Cox回归分析发现，EIF—5A2蛋白过度表达是浅表性膀胱癌患者术后复发(P=0.002)和术后进展(P=0.007)的独立预后指标。FISH检测发现，本组膀胱癌中有5.1％(3/59)的病例存在eIF—5A2基因的低水平扩增(gain)，8.5％(5/59)的病例出现高水平扩增(amplification)。另外，在13对新鲜的膀胱癌组织中，发现有8例(61.5％)存在eIF—5A2 mRNA的表达上调，其中4例(30.8％)同时存在蛋白的表达上调。
Ⅱ.RNA干扰eIF—5A2基因在结直肠癌SW480细胞中的表达对其增殖和侵袭能力的影响
1.筛选eIF—5A2基因沉然的稳定细胞株：限制性酶切凝胶电泳和DAN测序结果表明，两条沉()eIF—5A2基因的DNA序列成功连接到RNAi表达载体(pGPU6/GFP/Neo)上。荧光显微镜结果表明，eIF—5A2基因沉()质粒shRNA-1和shRNA—2成功转染SW480细胞，并获得了稳定转染的克隆。RT—PCR和蛋白印迹实验结果表明，在shRNA-1和shRNA—2稳定转染的两组细胞中，与对照组相比eIF—5A2的mRNA表达分别下降了87.2％和79.5％，蛋白表达则分别下降了90.2％和76.3％。
2.沉()eIF—5A2基因对细胞生物功能的影响：在shRNA-1和shRNA—2稳定转染的两组细胞中，发现沉()eIF—5A2基因的表达明显抑制了细胞的增殖、侵袭和克隆形成能力，并导致G1期细胞数的增多。
结论：
1.EIF—5A2蛋白过度表达与结直肠癌的淋巴结和远处血道转移均密切相关，可能在结直肠癌的转移中发挥着重要的作用。
2.EIF—5A2蛋白在卵巢肿瘤中的表达随肿瘤恶性程度的增加而表达上调，其过度表达与卵巢癌的局部浸润和转移密切相关，而且是判断卵巢癌患者生存的独立预后指标。
3.在膀胱癌中，EIF—5A2蛋白表达与肿瘤患者的临床病理学参数无关，但可以作为评估浸润型膀胱癌整体生存的独立指标；同时也是判断浅表性膀胱癌患者术后复发与进展的独立预后指标。
4.在结直肠癌、卵巢痛和膀胱癌中，eIF—5A2基因的扩增可能在其蛋白过度表达中起着重要的作用。
5.沉默eIF—5A2基因表达可明显抑制结直肠癌细胞的增殖及其侵袭和转移能力，并影响了细胞周期的进展；eIF—5A2基因在结直肠癌的发生发展中可能起着重要的作用，并可能成为结直肠癌治疗的新靶点。