论文部分内容阅读
目的：研究miRNA模拟物对尼古丁诱发心房纤维化的心脏保护作用，以及对CTGF的靶向特异性抑制作用。探讨基因特异性miRNA模拟物对由于miRNA下调所诱发疾病的治疗应用，解决单纯合成外源性miRNA缺乏基因特异性的缺陷，评价该方法用于疾病预防治疗的有效性。 方法：由公司按照提供的设计原则，人工合成miRNA模拟物(miR-CTGF)。体外，培养原代成纤维细胞并随机分为六组：空白对照组(Control)：尼古丁低剂量组(50nmol/L)；尼古丁高剂量组(500nmol/L)；miRNA模拟物+尼古丁高剂量组(+miR-CTGF)；miRNA模拟物+AMO+尼古丁高剂量组(+AMO-CTGF)；正常133+尼古丁高剂量组(+133)。用相应的因素刺激24h后，比色法测定各组成纤维细胞的胶原分泌量。实时定量RT-PCR测定Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原、结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor，CTGF)、转化生长因子TGF-β(Transforminggrowth factor-p，TGF-β)的mRNA表达。Western Blot技术检测CTGF和TGF-β1的表达。用Luciferase报告基因技术进一步验证miRNA模拟物与靶蛋白的相互作用。用细胞划痕实验证明miRNA模拟物对大鼠成纤维细胞增殖分化的影响。体内，健康成年雄性大鼠随机分为2组：正常对照组(Control)，尼占丁给药组(Nic500)。药物处理组(Nic500)为持续腹腔注射尼古丁30天.正常对照组(Control)每天注射等量生理盐水。30天后，按照上述分组，将其中15只给药组，3只对照组的大鼠心脏取出，直接消化成纤维细胞，并将药物处理组的成纤维细胞按照相应的组别，转染相应的microRNA。与Control组一起提蛋白，做Western Blot，检测TGF-β1和CTGF的表达。具体分组如下：Control组，Nic500组，+miR-CTGF组，+AMO-CTGF组，+NC组。剩余25只给药组.3只对照组的大鼠作为手术组，接受心脏点注射microRNA的手术。实验分组同上。并取各组心房组织，用Masson-trichrome进行染色。 结果：人工合成的miRNA模拟物能够下调成纤维细胞由于尼古丁刺激而生成的胶原量(P<0.05)。miR-CTGF可下调CTGF的表达(P<0.05)，但是并不能够改变TGF-β1的表达，说明了它对CTGF的靶向特异性抑制作用。Luciferase报告基因技术的结果可以看出，miR-133和miR-CTGF直接靶作用CTGF(P<0.05)，而TGF-β1却不是miR-CTGF作用的直接靶点，进一步说明了miR-CTGF作用的基因特异性。miR-CTGF可以使CTGF的mRNA水平下降(P<0.05)，对TGF-β1的mRNA水平没有显著的影响，说明了miR-CTGF在mRNA表达水平上的作用规律，它能够引起靶mRNA的降解，从而影响它在基因表达中的作用。体内实验的15只给药组，3只对照组的大鼠直接消化心脏成纤维细胞，转染相应的miRNA。Western Blot结果发现miR-CTGF可下调CTGF的表达(P<0.05).但是并不能够改变TGF-β1的表达，说明了它对CTGF的靶向特异性抑制作用。25只给药组.3只对照组的大鼠的Masson染色的实验结果显示，尼古丁处理后的心肌组织有大量结缔组织蓄积在纤维束之间，而miR-CTGF处理后的心肌组织排列整齐致密，周边有少量间质组织，纤维化程度明显显著减少(P<0.05)。 结论：根据TGF-β1的下游关键因子CTGF设计的microRNA模拟物(miR-CTGF)可基因特异性抑制CTGF的表达，解决了单纯合成外源性miRNA缺乏基因特异性的缺陷，起到对尼古丁所致心房纤维化的保护作用。