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胰岛β细胞作为唯一一类能够分泌胰岛素的分泌细胞，在机体的血糖调节中起着关键性的作用，而胰岛β细胞的生理活性会受到多种激素的共同调节。在已经发表的众多研究中，由小肠粘膜上皮Ⅰ细胞分泌的胆囊收缩素(Cholecystokinin，CCK)能够通过与胰岛β细胞中表达的胆囊收缩素A受体(Cholecystokinin A receptor，CCKAR)结合来对胰岛功能进行调节。 CCKAR作为G蛋白偶联受体家族中的一员，与内源性激动剂CCK的剪切变体CCK-8s结合后，会同时激活由Gs，Gq以及β-arrestin-1介导的多条下游信号通路，并调控不同的生理功能。在本实验室的前期研究中，已经证明了CCKAR受体与CCK-8s相互结合，能够通过激活下游的Gs和Gq信号通路。在胰岛β细胞中，细胞表面的CCKAR激活后，能够通过Gs信号通路调控胰岛β细胞的胰岛素分泌并改变机体的葡萄糖敏感性，也可以通过Gq信号通路直接影响并促进胰岛素的分泌。CCKAR与CCK-8s结合后，还能够激活β-arrestin-1信号通路，并促进Bad蛋白的磷酸化来弱化细胞凋亡的进程。这些研究结果表明CCKAR下游不同信号通路可调控胰岛β细胞不同的功能.但CCKAR偏向性途径具体的作用机制和CCKAR偏向性信号的生理意义尚不明确。 基于前期实验结果，我们通过设计并构建CCKAR与G蛋白或arrestin的人工融合蛋白(CCKAR-Gs，CCKAR-Gq和CCKAR-β-arrestin-1)，运用G蛋白偶联受体经典的下游信号检测手段对于不同融合蛋白的药理学特性进行检测，并进一步检测不同信号偏向性的信号途径对于细胞凋亡的相关作用，研究CCKAR下游不同信号通路所调控的生理功能，以其为基于CCKAR配体的糖尿病治疗药物的开发提供理论基础，并为其他GPCR的偏向性信号通路的研究提供新的思路。 研究目的 运用融合蛋白的技术手段构建CCKAR-Gs，CCKAR-Gq和CCCKAR-β- aresstin-1融合蛋白，并检测其相应的细胞生物学活性。 研究方法 1.融合蛋白的构建准备: (1)SLIC-PCR的手段进行融合蛋白的构建; (2)免疫印迹实验检测融合蛋白的表达情况; 2.药理学性质检测: (1)使用cAMP-GIoSensor的手段检测细胞中cAMP含量在CCK-8s刺激后的变化; (2)使用Fura-2钙成像的手段检测细胞中Ca离子在CCK-8s刺激后的变化; (3)使用免疫印迹的手段检测细胞中ppERK和pBad在CCK-8s刺激后的变化; 3.HEK293细胞系上表达不同融合蛋白(CCKAR-Gs，CCKAR-Gq，CCCKAR-β-aresstin-1)后细胞凋亡情况的检测 研究结果 人工构建的CKKAR融合蛋白比较野生型的CCKAR蛋白，能够在很大的程度上提高下游信号的偏向型，能够直接影响并作用于单一的信号通路上，并且CCKAR-β-arrestin-1融合蛋白的过表达能够显著改善细胞凋亡情况。 结论 人工构建的CCKAR融合蛋白能够有效地、偏向性地激活CCKAR的下游信号通路，可以选择性的行使不同信号通路调控的生理功能。