论文部分内容阅读
活性氧物质（ROS）是一类具有较高氧化反应性质的含氧化学物质。生命系统中ROS范畴也包括次氯酸（HClO）、单线态氧（1O2）、脂质过氧化物（ROOH）和臭氧（O3）。氧化与抗氧化的平衡状态对人体健康至关重要,如果这种平衡被打破,人体就会产生氧化应激反应,生命体过量的ROS会对蛋白质、核酸、脂质等大分子造成损伤,导致某种疾病的发生,最常见的就是有关衰老方面的疾病,如阿尔茨海默病。因此抗氧化剂、抗氧化酶、具有抗氧化性的纳米颗粒成为潜在抗氧化治疗药物,通过清除或中和ROS,从而抵抗氧化应激。具有抗氧化性的纳米颗粒可通过增加吸收来提高生物利用度,并且功能化后具有靶向性进而提高自身的清除ROS性能,相比于其他抗氧化剂具有独特的优势。这些纳米颗粒常见的有氧化铈、介孔二氧化硅、富勒烯等。然而,过量的ROS可导致细胞死亡的这一性质也可用于某些疾病的治疗。比如癌症,应用局部过量ROS杀死癌细胞。光动力治疗就是应用光敏剂在光照的条件下与周围的环境发生反应产生活性氧物质,进而杀死癌细胞。富勒烯作为第三种碳同素异形体,具有独特性质,一方面,富勒烯可在紫外光的激发下得到长寿命的三重激发态,随后因其独特的离域共轭体系可将能量或电子转移到分子氧,产生具有高反应活性的单线态氧（1O2）或超氧化物阴离子(O2·-),从而应用于光动力治疗,另一方面,富勒烯能够猝灭各种游离的自由基,被称为“自由基海绵”。因而富勒烯可以应用于清除自由基,阻断氧化应激通路,保护细胞及组织。因此,本课题就富勒烯的这种独特的性质进行了研究。（一）富勒烯衍生物C70-OEG对宫颈癌细胞的光动力治疗富勒烯可经紫外光的照射产生单线态氧,是良好的光敏剂,但是由于水溶性差,在生物介质中溶解度不好,限制了它的开发利用。因此需要对富勒烯进行官能团修饰,使其变为亲水性或两亲性物质。本研究利用寡聚乙二醇的亲水性、灵活的结构和良好的生物相容性对富勒烯进行官能团修饰得到亲水性富勒烯衍生物C70-OEG。将人宫颈癌细胞（HeLa）细胞分为6组,其中一组为暗处理,五组为光处理组,暗处理组与四组光处理组所加的C70-OEG浓度梯度相同,分别为0、1、1.5、2、2.5、5、10μmol/L,暗处理组的细胞与C70-OEG孵育24 h后,直接用CCK-8检测细胞活性;四组光处理组的细胞与C70-OEG孵育3 h,用20 mW/cm2白光分别照射0 min、5min、10 min、20 min后,用CCK-8检测细胞活性;第五光处理组所加药品为2μmol/L Ce6和不同浓度的C70-OEG,C70-OEG浓度分别为0、0.1、0.5、1、1.5、2、2.5μmol/L,经20 mW/cm2白光照射10 min,最后采用CCK-8检测细胞活性。分别对细胞核、细胞膜、线粒体、溶酶体染色,在共聚焦显微镜下观察细胞形态。C70-OEG作为光敏剂,经白光照射,产生单线态氧,可以有效杀死HeLa细胞,应用于光动力治疗。（二）PVP包覆的富勒烯(PVP@C60、PVP@C70)的抗氧化和抗炎研究富勒烯(C60、C70)经聚乙烯吡咯烷酮包覆得到PVP@C60和PVP@C70可溶于水,提高其生物利用度,因富勒烯被称为“自由基海绵”,可清除活性氧物质,当体内的氧化与抗氧化平衡被打破,过量的ROS可被富勒烯清除,保护细胞及组织。用过氧化氢刺激HEK细胞来建立氧化应激模型,不同浓度的PVP@C60和PVP@C70分别与HEK细胞孵育24 h,CCK-8检测细胞活性;不同浓度的PVP@C60和PVP@C70分别与处于氧化应激状态的HEK细胞作用,用CCK-8检测细胞活性。用LPS刺激小鼠巨噬细胞RAW 264.7来建立氧化应激和炎症模型。在有或无LPS刺激下,不同浓度的PVP@C60和PVP@C70与RAW 264.7孵育20 h,用DCFH-DA检测其产生活性氧的情况。在LPS刺激RAW 264.7建立的氧化应激和炎症模型中,不同浓度的PVP@C60和PVP@C70与RAW 264.7孵育20 h,用ELISA检测IL-2、TNF-α,和iNOS mRNA表达量,Western blot检测p-ERK1/2、ERK1/2、p-AKT、AKT的蛋白表达量。在氧化应激模型中,验证了PVP@C60和PVP@C70有清除自由基的能力,保护细胞免受损伤;在炎症模型中,PVP@C60和PVP@C70有效的抑制了TNF-α、iNOS的释放,增加了IL-2的释放;有效的抑制了ERK1/2的磷酸化。