毒死蜱对大型溞种群发育进度、ChE活性和NAGase释放量的影响

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胆碱酯酶(Cholinestersae,ChE)和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(β-N-Acetyl-D-glucosaminidase,NAGase)是环境科学中两种重要的生物指示物。本文尝试构建以大型溞为主体的实验体系,检测大型溞在毒死蜱胁迫下的种群密度变化情况,同步测量被胁迫种群体内ChE活性交化以及NAGase水中释放量变化,探索其相关性。  从大型溞体内ChE分离提纯得到分子量分别为57KD和84KD的组分A和组分B。底物特异性实验表明,组分A、组分B能水解碘化硫代乙酰胆碱(ATCh)、碘化硫代丙酰胆碱(PTCh)、碘化硫代丁酰胆碱(BTCh)。在较低浓度下,随着底物浓度增加,酶的水解速率加快,当三种底物浓度达到2.5mmol/L时,水解速率达到最大值,之后出现底物浓度抑制现象,组分A、组分B对ATCh和PTCh亲和性要高于BTCh,对于组分A,Km值分别为0.142、0.139mmol/L,对于组分B,Km值分别为0.151、0.146mmol/L。毒死蜱氧化代谢物、马拉氧磷和敌百虫对于4种不同生物来源的ChE的抑制性实验表明,大型溞体内提纯的ChE对毒死蜱氧化代谢产物最敏感,对马拉氧磷次之,敌百虫最不敏感。最后以组分A作为免疫原制备多克隆抗体。  在利用ELISA法检测酶含量方面,比较了间接非竞争ELISA和间接竞争ELISA法。对于ChE,间接非竞争ELISA的最适抗原浓度和抗体稀释倍数分别为1.5μg/mL和1∶10000,检测灵敏度为7.4ng/mL;对于ChE,间接竞争ELISA的最适抗原浓度和抗体稀释倍数分别为5.3μg/mL和1∶8000,检测灵敏度为0.16ng/mL。对于NAGase,间接非竞争ELISA的最适抗原浓度和抗体稀释倍数分别为9.0μg/mL和1∶6000,检测灵敏度为4.2ng/mL;对于NAGase,间接竞争ELISA的最适抗原浓度和抗体稀释倍数分别为6.5μg/mL,和1∶4000,检测灵敏度为0.25ng/mL。可见无论是ChE还是NAGase,间接竞争ELISA在最适抗原抗体浓度下的检测灵敏度均高于间接非竞争ELISA。  以施药理论浓度来表示大型溞种群密度、水体NAGase酶活性、水体NAGase蛋白含量、ChE内在活性和ChE表观活性的NOEC分别为0.1μg/L、0.02μg/L、0.1μg/L、<0.02μg/L和0.1μg/L。这表明以大型溞ChE内在活性表征的NOEC数值最小,其灵敏度较传统的计数方法有明显提高。研究结果还显示大型溞ChE内在活性的抑制率在10%-90%的范围内与大型溞种群密度的下降率在10%-50%的范围内存在“剂量-反应关系”,可以作为种群发育抑制作用的指示因子。
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