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传统中草药淫羊藿为小檗科淫羊藿属植物,异戊烯黄酮醇苷化合物如淫羊藿苷和朝藿定A-C含量甚高。为了研究类黄酮糖基转移酶(flavonoidglycosyltransferase)在黄酮醇苷生物合成中的作用,本实验提取粗毛淫羊藿(Epimedium acuminatum Franeh.)变色期叶片为材料,采用相似性克隆的策略,得到4条类黄酮糖基转移酶基因,分别命名为EaGT1、EaGT2/EaGT2S、EaGT3/EaGT3S和EaGT4。根据氨基酸序列构建进化树显示-EaGT1和EaGT2属于ClusterⅡ,EaGT3属于ClusterⅣ,EaGT4属于ClusterⅢ。半定量RT-PCR显示各基因在茎叶中存在表达差异:EaGT2在茎叶中都有表达,且表达量一致;EaGT3在茎叶中都有表达,但叶中表达量明显高于茎。通过基因组织特异性表达的检测,结合氨基酸序列的进化树分析,推测EaGT3和EaGT4很可能参与淫羊藿类黄酮生物合成中的糖基化反应。采用大肠杆菌异源表达系统,将EaGT基因构建到表达载体pET32a(+)和pET28a(+)中,在表达菌RosettaTM2(DE3)plysS、Rosetta-gamiB(DE3)和BL21(DE3)中只得到包涵体,没有可溶的目标融合蛋白。以包涵体作为粗酶,kaempferol为底物进行酶反应,LC/MS没有检测到目的产物。
以看家基因(Actin)为内标,对来自粗毛淫羊藿的类黄酮异戊烯基转移酶(flavonoid prenyltransferase)疑似基因EaPT1、EaPT2进行组织特异性表达检测。半定量RT-PCR结果证明EaPT1在茎叶中表达量一致,而EaPT2只在叶片中表达。
毛萼香茶菜(Isodon eriocalyx(Dunn) Kudo)中的对映-贝壳杉烯类二萜具有抗菌消炎和抗肿瘤活性,CPS(copalyl pyrophosphate synthase)是参与其生物合成的酶。利用半定量RT-PCR对毛萼香茶菜IeCPS1和IeCPS2在植物不同发育时期的组织特异性表达进行了检测,结果表明IeCPS1既在幼叶中表达显著,也在剐萌发的幼苗和成熟叶中表达;IeCPS2只在叶片中表达,而刚萌发的幼苗不表达。
论文最后综述了近年来植物类黄酮糖基转移酶的研究进展,主要包括糖基转移酶的分类、晶体结构和酶反应机制。