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阿尔巴斯绒山羊是在内蒙古干旱荒漠、半荒漠草场特殊的生态环境下培育出的优良品种，其生产的羊绒被誉为“软黄金”、“纤维宝石”。对影响阿尔巴斯绒山羊产绒量的因素开展研究具有很大的科学意义以及研究价值。本实验室前期获得了转血管内皮生长因子164(Vascular endothelial growth factor164，VEGF164)基因绒山羊，其羊绒产量比对照组显著提高，所以很有必要研究其提高的原因。本实验在体外条件下，探讨了转VEGF164基因毛乳头细胞(Dermalpapilla cells，DPCs)对血管内皮细胞(Vascular endothelial cells，VECs)的作用，VEGF164细胞因子对VECs生长状况的影响及对VECs形成管腔样结构的影响，以及转VEGF164基因毛乳头细胞对自身生长的影响，以便初步了解VEGF164提高产绒量是通过促进毛囊周围血管分布增多间接促进毛囊的增多，还是VEGF164直接促进毛囊的增多。上述研究成果对探讨影响羊绒生长的因素及其作用机制具有重要的参考价值。 一、阿尔巴斯绒山羊PHF-DPCs、SHF-DPCs、VECs建系 1.PHF-DPCs、SHF-DPCs培养 将本实验室保存的初级毛囊毛乳头细胞(Primary hair follicle dermal papillacells，PHF-DPCs)、次级毛囊毛乳头细胞(Second hair follicle dermal papilla cells，SHF-DPCs)进行扩大培养。结果表明，PHF-DPCs、SHF-DPCs均可以正常传代、冻存、复苏。 2.VECs分离培养及鉴定 利用酶消化法分离培养VECs，将分离得到的VECs用细胞免疫组织化学法进行鉴定，细胞流式进行细胞纯度检测。结果表明，VECs可以正常传代培养到第7代，表达血管假性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)，而且细胞纯度达到99.6％。 二、毛囊特异表达载体pCDsRed2-KV转染PHF-DPCs、SHF-DPCs及鉴定 将构建好的VEGF164基因毛囊特异表达载体pCDsRed2-KV以Lipofectamine@LTX and PLUSTM分别介导转染PHF-DPCs和SHF-DPCs。转染48h后，用含500ng/ml G418的培养液筛选7天，之后再用含300ng/ml G418的培养液维持培养3天，得到稳定转染的细胞克隆。提取细胞克隆的DNA，进行PCR鉴定，并得到特异性条带。提取细胞克隆总RNA，反转录后进行实时荧光定量PCR鉴定，结果转VEGF164基因PHF-DPCs的mRNA是对照组的1.7倍，转VEGF164基因SHF-DPCs的mRNA是对照组的3.9倍。结果表明，外源VEGF164整合到PHF-DPCs、SHF-DPCs基因组中，并能转录VEGF164的mRNA。 三、VEGF164对毛乳头细胞与血管内皮细胞体外相互作用影响的研究1.转基因DPCs对VECs的影响 将转VEGF164基因PHF-DPCs和SHF-DPCs分别与血管内皮细胞用Transwell共培养。共培养7天后，收集VECs，利用实时荧光定量PCR检测VECs与对照组的变化。结果与PHF-DPCs共培养的VECs CD31mRNA相对表达量是对照组的1.2倍，与SHF-DPCs共培养的VECs CD31 mRNA相对表达量是对照组的0.69倍。与PHF-DPCs共培养的VECs CD34 mRNA相对表达量是对照组的1.18倍，与SHF-DPCs共培养的VECs CD34 mRNA相对表达量是对照组的0.9倍。实验结果表明，在共培养的情况下，DPCs分泌的VEGF164对VECs的增殖几乎没有太大的影响，但DPCs与VECs共培养可以减缓VECs老化。 2.添加细胞因子对VECs的影响 分别添加10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml VEGF164和10ng/ml、20ng/ml、30ng/mlVEGFD培养VECs，并在合适浓度下，检测VEGF164、VEGFD对VECs生长的影响，同时检测对VECs形成管腔样结构的影响。实验结果为10ng/mlVEGF164、10ng/ml VEGFD对VECs生长影响最大。添加10ng/ml VEGF164培养VECs中，CD31 mRNA相对表达量是对照组的1.55倍; CD34 mRNA相对表达量是对照组的1.68倍。结果表明，VEGF164、VEGFD均有促进VECs增殖生长的作用，而且均能促进VECs形成管腔样结构，但VEGFD作用效果更强。 3.转VEGF164基因PHF-DPCs和SHF-DPCs对自身生长的影响 分别对转VEGF164基因的PHF-DPCs和SHF-DPCs进行细胞计数，同时对添加10ng/mlVEGF164细胞因子的PHF-DPCs、SHF-DPCs也进行细胞计数实验。结果表明，转基因DPCs能促进自身的增殖生长，且促进生长的能力比添加VEGF164细胞因子的强，即转VEGF164基因DPCs促进自身生长的效果更好。 综上所述，VEGF164既可以促进VECs的增殖生长，也可以促进DPCs增殖生长。但转VEGF164基因DPCs对自身的促进作用大于对VECs的促进作用。本实验的结果为之后进一步深入研究DPCs与VECs的关系提供了一些线索。