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研究背景:
本论文分析了支架蛋白SHOC2在乳腺癌发生、发展中的作用及对乳腺癌患者预后的影响，并初步研究SHOC2介导Raf-ERK通路在乳腺癌mTOR通路抑制剂依维莫司耐药机制中的调控作用，为乳腺癌靶向治疗的深入研究奠定了理论和实验基础。
第一部分 SHOC2表达与乳腺癌患者病理参数和预后的相关性及对乳腺癌细胞增殖、凋亡和Ras通路的调控
研究目的:
通过检测SHOC2基因及蛋白在乳腺癌组织和癌旁组织中的表达，并分析与乳腺癌患者的临床病理参数之间的关系，初步探讨了SHOC2在乳腺癌中表达的临床意义;通过体外实验研究SHOC2表达对于乳腺癌细胞增殖、周期、凋亡及Ras通路的调控作用。
研究方法:
应用qRT-PCR、Western Blotting分别检测11例乳腺癌组织及匹配癌旁组织中SHOC2的mRNA和蛋白的表达水平的表达水平，免疫组织化学染色方法进一步检测了120例乳腺癌组织和匹配癌旁组织中SHOC2蛋白的表达水平，回顾性分析SHOC2蛋白的表达与患者临床病理参数之间的相关性，及对于乳腺癌患者预后的意义。在体外实验中，通过敲低及过表达SHOC2，运用MTT、流式细胞及Western Blotting分别检测SHOC2对于乳腺癌细胞增殖、周期、凋亡及Ras通路的调控作用。
研究结果:
1.qRT-PCR、Western Blotting及免疫组织化学染色结果均显示SHOC2的基因和蛋白表达水平在乳腺癌组织中较癌旁乳腺组织均有明显升高(P＜0.01)。
2.乳腺癌组织中SHOC2蛋白的高表达与乳腺癌患者的组织学分级(P＜0.001)、肿瘤大小(P=0.023)、ER状态(P=0.028)密切相关，而与性别、年龄、PR、HER2状态和淋巴结转移状态无关。生存分析表明，SHOC2蛋白高表达可以显著降低乳腺癌患者的总生存率(P＜0.001)，并且对于ER阴性的乳腺癌患者影响更为明显。对于影响乳腺癌预后的因素行单因素及多因素分析结果显示，SHOC2的表达水平是乳腺癌患者预后的独立影响因子。
3.体外实验结果证明SHOC2敲低之后，抑制乳腺癌细胞的增殖能力明显受到抑制(P＜0.001);而S期乳腺癌细胞比例明显降低(P＜0.001)并促进细胞的凋亡(P＜0.001)，这可能是乳腺癌细胞增殖抑制的重要原因。另外，通路Western Blotting实验结果显示，SHOC2敲低可以显著抑制乳腺癌细胞Ras通路的激活，而过表达SHOC2可以激活Ras通路，促进细胞增殖。
研究结论:
1.SHOC2在乳腺癌的发生过程中发挥重要作用，并影响乳腺癌患者的预后。
2.SHOC2表达水平可以可影响乳腺癌细胞的增殖与凋亡，并且可能是通过Ras通路调控。
第二部分 SHOC2介导的Raf-1-ERK通路活化在乳腺癌细胞mTOR抑制剂依维莫司耐药中的作用
研究目的:
研究SHOC2蛋白在乳腺癌细胞mTOR抑制剂依维莫司耐药中的作用，同时研究其作用的具体机制。
研究方法:
应用CCK-8细胞增殖实验检测不同乳腺癌细胞株对于依维莫司的药物敏感性，初步筛选依维莫司耐药的细胞细胞系，流式细胞技术检测依维莫司对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231及Hs578T周期的影响。用Western Blotting方法检测依维莫司处理后乳腺癌细胞系内mTOR通路及Raf-1-ERK通路的变化以及敲低SHOC2后对于Raf-1-ERK通路的影响，运用免疫共沉淀实验研究SHOC2蛋白与Raf-1之间是否存在相互作用及变化趋势。依维莫司联合使用Raf-1-ERK通路抑制剂PD98059，Western Blotting检测细胞通路的变化，CCK-8细胞增殖实验检测检测细胞增殖变化，流式细胞技术检测乳腺细胞周期变化。
研究结果:
1.Luminal A型乳腺癌细胞系T47D、MCF-7及三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231、Hs578T对mTOR抑制剂依维莫司相对耐药，IC50均大于100nM.Her2阳性乳腺癌细胞系BT474对依维莫司相对敏感，IC50小于100nM。结合第一部分结果，我们选择三阴性乳腺癌细胞系进行进一步的实验研究。
2.mTOR抑制剂依维莫司作用于耐药的MDA-MB-231，Hs578T三阴性乳腺癌细胞系的实验中，依维莫司分别以浓度梯度和时间梯度作用MDA-MB-231，Hs578T三阴性乳腺癌细胞的Western Blotting结果显示，Raf-1(S338)磷酸化表达逐渐增多，下游的ERK表达逐渐上调，Raf-1-ERK通路被反馈激活。对其通路活化的机制进行研究，免疫共沉淀结果显示SHOC2与Raf-1结合明显增强，促进了Raf-1的磷酸化活化及下游ERK通路的活化。
3.敲低SHOC2可以明显抑制mTOR抑制剂依维莫反馈激活的Raf-1-ERK通路。依维莫司作用乳腺癌细胞后，p-mTOR表达受到抑制，稳定敲低组SHOC2表达明显降低，依维莫司作用于对照组及空转染组后Raf-1-ERK通路被激活，p-Raf-1(S338)表达上调，p-ERK表达也随之升高，而SHOC2+依维莫司组，p-Raf-1(S338)及p-ERK表达均明显下调，说明SHOC2敲低可显著抑制依维莫司引起的Raf-1-ERK。
4.Western Blotting结果显示Raf-1-ERK通路MEK1抑制剂PD98059可以显著抑制Raf-1-ERK及反馈激活的Raf-1-ERK通路，p-ERK表达明显降低。CCK8细胞增殖实验及流式细胞周期结果显示抑制剂抑制反馈激活的Raf-1-ERK通路可以增强MDA-MB-231，Hs578T三阴性乳腺癌细胞对于mTOR抑制剂依维莫司的敏感性，抑制剂联合依维莫司组细胞增值能力较其他各组明显减弱(P＜0.001)，细胞周期阻滞于G0/G1期，S期细胞比例明显降低（P＜0.001）。
研究结论:
1.SHOC2作为Raf-ERK通路的调节蛋白，可以通过增强与Raf-1的结合促进Raf-1的磷酸化活化，参与了依维莫司耐药乳腺癌细胞内反馈通路Raf-1-ERK通路的激活;
2.通过抑制反馈激活的Raf-1-ERK通路，可以增加乳腺癌细胞对于依维莫司的敏感性，所以SHOC2介导的Raf-1-ERK通路反馈激活机制有可能是乳腺癌细胞依维莫司耐药的重要机制。
第三部分 敲低SHOC2对于改善乳腺癌细胞对于mTOR抑制剂依维莫司敏感性的研究
研究目的:
体外实验检测SHOC2蛋白对于乳腺癌细胞依维莫司敏感性的影响，体内实验进一步验证敲低SHOC2之后裸鼠成瘤对于依维莫司敏感性。
研究方法:
运用RNAi方法特异性地抑制SHOC2基因及其蛋白的表达，体外细胞CCK-8实验、平板克隆形成实验、流式细胞实验检测SHOC2蛋白敲低联合依维莫司之后，细胞增殖能力、细胞周期及凋亡的变化。裸鼠成瘤实验检测SHOC2蛋白敲低之后裸鼠成瘤对于依维莫司的敏感性。
研究结果:
1.在MDA-MB-231、Hs578T三阴性乳腺癌中，敲低SHOC2联合mTOR抑制剂依维莫司组细胞的增殖能力及克隆形成能力较其对照组、空转染组、SHOC2敲低组及依维莫司单药组明显受到抑制，敲低SHOC2可以显著增强依维莫司抑制细胞增殖(P＜0.001)及克隆形成(P＜0.001)的能力;
2.在MDA-MB-231、 Hs578T三阴性乳腺癌中，流式周期实验结果显示敲低SHOC2联合mTOR抑制剂依维莫司组细胞较其他各组S期比例明显降低，流式凋亡实验显示联合组凋亡比例明显升高，Western Blotting结果显示，联合组周期特异性蛋白Cyclin D1表达明显下调，抑制凋亡蛋白Bcl-2表达减少，促凋亡蛋白Bax、Ceaved-caspase3表达升高。这说明，敲低SHOC2联合mTOR抑制剂依维莫司可以显著抑制乳腺癌细胞进入S期(P＜0.001)，并促进细胞凋亡(P＜0.001);
3.裸鼠成瘤实验中，结果显示敲低SHOC2联合依维莫司组裸鼠成瘤较其他组明显减小(P＜0.001)，对于裸鼠肿瘤组织的Western Blotting结果显示，SHOC2敲低可明显抑制反馈激活的Raf-1-ERK通路。所以，SHOC2敲低抑制反馈激活的Raf-1-ERK通路可增强裸鼠皮下移植瘤对于依维莫司敏感性，抑制裸鼠种瘤生长。
研究结论:
1.体外实验中，敲低SHOC2可以增强mTOR抑制剂依维莫司对于细胞增殖的抑制作用以及增强mTOR抑制剂依维莫司对于乳腺癌细胞周期阻滞效应和促细胞凋亡作用;
2.体内实验中，敲低SHOC2可以增强依维莫司对于裸鼠皮下成瘤的抑制。
本论文分析了支架蛋白SHOC2在乳腺癌发生、发展中的作用及对乳腺癌患者预后的影响，并初步研究SHOC2介导Raf-ERK通路在乳腺癌mTOR通路抑制剂依维莫司耐药机制中的调控作用，为乳腺癌靶向治疗的深入研究奠定了理论和实验基础。
第一部分 SHOC2表达与乳腺癌患者病理参数和预后的相关性及对乳腺癌细胞增殖、凋亡和Ras通路的调控
研究目的:
通过检测SHOC2基因及蛋白在乳腺癌组织和癌旁组织中的表达，并分析与乳腺癌患者的临床病理参数之间的关系，初步探讨了SHOC2在乳腺癌中表达的临床意义;通过体外实验研究SHOC2表达对于乳腺癌细胞增殖、周期、凋亡及Ras通路的调控作用。
研究方法:
应用qRT-PCR、Western Blotting分别检测11例乳腺癌组织及匹配癌旁组织中SHOC2的mRNA和蛋白的表达水平的表达水平，免疫组织化学染色方法进一步检测了120例乳腺癌组织和匹配癌旁组织中SHOC2蛋白的表达水平，回顾性分析SHOC2蛋白的表达与患者临床病理参数之间的相关性，及对于乳腺癌患者预后的意义。在体外实验中，通过敲低及过表达SHOC2，运用MTT、流式细胞及Western Blotting分别检测SHOC2对于乳腺癌细胞增殖、周期、凋亡及Ras通路的调控作用。
研究结果:
1.qRT-PCR、Western Blotting及免疫组织化学染色结果均显示SHOC2的基因和蛋白表达水平在乳腺癌组织中较癌旁乳腺组织均有明显升高(P＜0.01)。
2.乳腺癌组织中SHOC2蛋白的高表达与乳腺癌患者的组织学分级(P＜0.001)、肿瘤大小(P=0.023)、ER状态(P=0.028)密切相关，而与性别、年龄、PR、HER2状态和淋巴结转移状态无关。生存分析表明，SHOC2蛋白高表达可以显著降低乳腺癌患者的总生存率(P＜0.001)，并且对于ER阴性的乳腺癌患者影响更为明显。对于影响乳腺癌预后的因素行单因素及多因素分析结果显示，SHOC2的表达水平是乳腺癌患者预后的独立影响因子。
3.体外实验结果证明SHOC2敲低之后，抑制乳腺癌细胞的增殖能力明显受到抑制(P＜0.001);而S期乳腺癌细胞比例明显降低(P＜0.001)并促进细胞的凋亡(P＜0.001)，这可能是乳腺癌细胞增殖抑制的重要原因。另外，通路Western Blotting实验结果显示，SHOC2敲低可以显著抑制乳腺癌细胞Ras通路的激活，而过表达SHOC2可以激活Ras通路，促进细胞增殖。
研究结论:
1.SHOC2在乳腺癌的发生过程中发挥重要作用，并影响乳腺癌患者的预后。
2.SHOC2表达水平可以可影响乳腺癌细胞的增殖与凋亡，并且可能是通过Ras通路调控。
第二部分 SHOC2介导的Raf-1-ERK通路活化在乳腺癌细胞mTOR抑制剂依维莫司耐药中的作用
研究目的:
研究SHOC2蛋白在乳腺癌细胞mTOR抑制剂依维莫司耐药中的作用，同时研究其作用的具体机制。
研究方法:
应用CCK-8细胞增殖实验检测不同乳腺癌细胞株对于依维莫司的药物敏感性，初步筛选依维莫司耐药的细胞细胞系，流式细胞技术检测依维莫司对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231及Hs578T周期的影响。用Western Blotting方法检测依维莫司处理后乳腺癌细胞系内mTOR通路及Raf-1-ERK通路的变化以及敲低SHOC2后对于Raf-1-ERK通路的影响，运用免疫共沉淀实验研究SHOC2蛋白与Raf-1之间是否存在相互作用及变化趋势。依维莫司联合使用Raf-1-ERK通路抑制剂PD98059，Western Blotting检测细胞通路的变化，CCK-8细胞增殖实验检测检测细胞增殖变化，流式细胞技术检测乳腺细胞周期变化。
研究结果:
1.Luminal A型乳腺癌细胞系T47D、MCF-7及三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231、Hs578T对mTOR抑制剂依维莫司相对耐药，IC50均大于100nM.Her2阳性乳腺癌细胞系BT474对依维莫司相对敏感，IC50小于100nM。结合第一部分结果，我们选择三阴性乳腺癌细胞系进行进一步的实验研究。
2.mTOR抑制剂依维莫司作用于耐药的MDA-MB-231，Hs578T三阴性乳腺癌细胞系的实验中，依维莫司分别以浓度梯度和时间梯度作用MDA-MB-231，Hs578T三阴性乳腺癌细胞的Western Blotting结果显示，Raf-1(S338)磷酸化表达逐渐增多，下游的ERK表达逐渐上调，Raf-1-ERK通路被反馈激活。对其通路活化的机制进行研究，免疫共沉淀结果显示SHOC2与Raf-1结合明显增强，促进了Raf-1的磷酸化活化及下游ERK通路的活化。
3.敲低SHOC2可以明显抑制mTOR抑制剂依维莫反馈激活的Raf-1-ERK通路。依维莫司作用乳腺癌细胞后，p-mTOR表达受到抑制，稳定敲低组SHOC2表达明显降低，依维莫司作用于对照组及空转染组后Raf-1-ERK通路被激活，p-Raf-1(S338)表达上调，p-ERK表达也随之升高，而SHOC2+依维莫司组，p-Raf-1(S338)及p-ERK表达均明显下调，说明SHOC2敲低可显著抑制依维莫司引起的Raf-1-ERK。
4.Western Blotting结果显示Raf-1-ERK通路MEK1抑制剂PD98059可以显著抑制Raf-1-ERK及反馈激活的Raf-1-ERK通路，p-ERK表达明显降低。CCK8细胞增殖实验及流式细胞周期结果显示抑制剂抑制反馈激活的Raf-1-ERK通路可以增强MDA-MB-231，Hs578T三阴性乳腺癌细胞对于mTOR抑制剂依维莫司的敏感性，抑制剂联合依维莫司组细胞增值能力较其他各组明显减弱(P＜0.001)，细胞周期阻滞于G0/G1期，S期细胞比例明显降低（P＜0.001）。
研究结论:
1.SHOC2作为Raf-ERK通路的调节蛋白，可以通过增强与Raf-1的结合促进Raf-1的磷酸化活化，参与了依维莫司耐药乳腺癌细胞内反馈通路Raf-1-ERK通路的激活;
2.通过抑制反馈激活的Raf-1-ERK通路，可以增加乳腺癌细胞对于依维莫司的敏感性，所以SHOC2介导的Raf-1-ERK通路反馈激活机制有可能是乳腺癌细胞依维莫司耐药的重要机制。
第三部分 敲低SHOC2对于改善乳腺癌细胞对于mTOR抑制剂依维莫司敏感性的研究
研究目的:
体外实验检测SHOC2蛋白对于乳腺癌细胞依维莫司敏感性的影响，体内实验进一步验证敲低SHOC2之后裸鼠成瘤对于依维莫司敏感性。
研究方法:
运用RNAi方法特异性地抑制SHOC2基因及其蛋白的表达，体外细胞CCK-8实验、平板克隆形成实验、流式细胞实验检测SHOC2蛋白敲低联合依维莫司之后，细胞增殖能力、细胞周期及凋亡的变化。裸鼠成瘤实验检测SHOC2蛋白敲低之后裸鼠成瘤对于依维莫司的敏感性。
研究结果:
1.在MDA-MB-231、Hs578T三阴性乳腺癌中，敲低SHOC2联合mTOR抑制剂依维莫司组细胞的增殖能力及克隆形成能力较其对照组、空转染组、SHOC2敲低组及依维莫司单药组明显受到抑制，敲低SHOC2可以显著增强依维莫司抑制细胞增殖(P＜0.001)及克隆形成(P＜0.001)的能力;
2.在MDA-MB-231、 Hs578T三阴性乳腺癌中，流式周期实验结果显示敲低SHOC2联合mTOR抑制剂依维莫司组细胞较其他各组S期比例明显降低，流式凋亡实验显示联合组凋亡比例明显升高，Western Blotting结果显示，联合组周期特异性蛋白Cyclin D1表达明显下调，抑制凋亡蛋白Bcl-2表达减少，促凋亡蛋白Bax、Ceaved-caspase3表达升高。这说明，敲低SHOC2联合mTOR抑制剂依维莫司可以显著抑制乳腺癌细胞进入S期(P＜0.001)，并促进细胞凋亡(P＜0.001);
3.裸鼠成瘤实验中，结果显示敲低SHOC2联合依维莫司组裸鼠成瘤较其他组明显减小(P＜0.001)，对于裸鼠肿瘤组织的Western Blotting结果显示，SHOC2敲低可明显抑制反馈激活的Raf-1-ERK通路。所以，SHOC2敲低抑制反馈激活的Raf-1-ERK通路可增强裸鼠皮下移植瘤对于依维莫司敏感性，抑制裸鼠种瘤生长。
研究结论:
1.体外实验中，敲低SHOC2可以增强mTOR抑制剂依维莫司对于细胞增殖的抑制作用以及增强mTOR抑制剂依维莫司对于乳腺癌细胞周期阻滞效应和促细胞凋亡作用;
2.体内实验中，敲低SHOC2可以增强依维莫司对于裸鼠皮下成瘤的抑制。