疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因的克隆及功能验证

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白叶枯病(Xanthomonas oryzae Pv.Oryzae,Xoo)是水稻最严重的细菌性病害之一,每年造成严重的产量损失。由于病原菌生理小种的不断变异使得栽培稻原有的抗白叶枯病基因逐渐丧失抗性,目前对白叶枯病的防治,尚未有行之有效的措施。疣粒野生稻具高抗或免疫白叶枯病的基因,且与目前已经发现的30个抗白叶枯病基因的抗菌谱不相同,可能具有新的抗白叶枯病基因。因此,发掘高抗白叶枯病的水稻野生近缘种,并从中克隆和利用高抗白叶枯病相关基因具有重要的意义。   本研究从疣粒野生稻抑制消减cDNA文库(SSH)中获得31个与抗病相关的EST,从中挑选3个EST,通过RACE方法获得了2个基因(ME094,ME255)的全长cDNA序列,通过比对分析,发现ME094基因编码的氨基酸与金属硫蛋白有较高的同源性,推导的氨基酸具有一个与金属硫蛋白所共有的结构域,推测当疣粒野生稻受到白叶枯病病原菌胁迫时,ME094基因通过其编码的金属硫蛋白的一系列反应,得以增强机体的应激性。对ME255基因的功能域进行预测发现,该基因编码的蛋白具有泛素结合酶结构域和半胱氨酸蛋白酶结构域。将疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因ME094构建高表达载体pCAMBIA1300-BI-ME094,通过农杆菌介导法导入拟南芥和02428粳稻进行基因功能的验证。ME094基因转化拟南芥后发现转基因阳性苗的植株形态与对照组有一定的差异性,同时用白叶枯病病原菌接种后,阳性拟南芥具有明显的抗病性,因此推测ME094基因在拟南芥中的过量表达,对拟南芥的生长发育产生了影响。ME094基因对02428粳稻的转化实验目前处于抗性愈伤组织筛选中,后续的分化、生根及转基因植株的鉴定将由实验室工作人员完成。将实验室已经得到了全长cDNA序列的抗白叶枯病相关基因ME207,通过农杆菌介导法转化到02428粳稻中以验证该基因的抗病性。转化后获得12株再生植株,通过PCR检测初步确定有2株为转基因阳性苗,这2株植株茎杆与对照材料组存在差异,与疣粒野生稻茎杆相似,通过接菌实验发现转基因植株出现白叶枯病症状比对照材料晚,且病斑长度较对照的短。同时对ME207基因在阳性植株中的表达情况进行检测,发现ME207基因在转基因阳性苗中是受白叶枯病病原菌的诱导而表达的。本研究从基因分子学角度认识疣粒野生稻高抗白叶枯病机制,为进一步克隆疣粒野生稻高抗白叶枯病基因奠定了基础,同时通过农杆菌介导法成功地将抗白叶枯病相关基因ME207转化到水稻中,使该基因的抗病性功能得到进一步的验证。
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