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酵母菌在乙醇生产中占有重要地位。纤维素乙醇是目前能源、工业、环保等领域中研究的热点问题,纤维素的利用和利用程度直接影响纤维素乙醇的生产。木糖是纤维素水解产物中的主要成分之一,筛选能够利用木糖产生酒精的酵母菌株尤为重要。云南省独特的气候条件和地理位置提供了丰富的酵母菌资源,同时,云南省多样的植物资源使纤维素的来源更为丰富,对可利用木糖的酵母菌起到一个天然筛选的作用。
作者研究了云南省部分地区酵母资源多样性,同时对可利用木糖的酵母菌进行筛选。在此基础上,选出三株木糖利用率较高的菌株,对其木糖利用、菌体生长和酒精产率等方面进行分析,最后对木糖异构酶基因工程菌构建进行初探。
本论文得到以下结果:
1、在云南省境内的20个地区以及广西北海银滩海边高盐地区有针对性采集了680份样品,共分离到酵母菌1100株,已鉴定255株分属于23个属68个种;
2、根据植物组织、水体、垃圾、土壤、昆虫组织五种不同来源的酵母菌物种多样性分析,植物组织来源的物种最为丰富,Candida tropicalis,Pichia kudriavzevii两个种在五种来源中均有分布;
3、所鉴定酵母的地理分布多样性调查结果表明,云南省酵母菌在不同的地理分布环境中具有较高的物种多样性,北热带气候区酵母菌物种资源最为多样,分布最为均衡,广西北海市沿海区域酵母菌总检出率较低;Issatchenkia orientalis酵母在六种所调查的地理环境中均有分布。
4、对极端环境(高温、高盐及铅锌矿区)酵母菌的物种多样性分析显示,高温酵母集中在Candida、Kluyveromyces、Pichia、Rhodotorula和Saccharomyces五个属,优势种为Candida tropicalis与Pichia guilliermondii;铅锌矿区酵母集中在Pichia guilliermondii、Rhodotorula mucilaginosa、Wickerhamomyces anomalus、Williopsis saturnus,Zygowilliopsis californica五个种,且分布较为均衡;高盐地区酵母菌主要集中在五个属,九个种。Pichia与Issatchenkia为优势属,Issatchenkiaorientalis为优势种。
5、在酵母菌利用木糖方面,共获得并鉴定可利用木糖作为唯一碳源的酵母菌38株,分属于9个属18个种,其中有6个属Geotrichum、Kluyveromyces、Saccharomycetales,Trichosporon、Wickerhamomyces,Zygosaccharomyces为首次发现其木糖利用能力;
6、对两株异常毕赤酵母(MLB1、QJFQ1-3),一株酿酒酵母(YGQB1)的木糖发酵分析表明,MLB1木糖利用率为100％,酒精产率为0.057g/(Lh);QJFQ1-3木糖利用率为72%,酒精产率为0.058g/(Lh);YGQB1作为首次被发现的可直接利用木糖的酿酒酵母,木糖利用率为57%;酒精浓度最大值为0.181gl-1。通过对YGQB1与工业酿酒酵母菌株乙醛还原酶基因(Gre3)和木糖醇脱氢酶基因(Xy12)及其上下游的序列进行比较,得出:两个基因核苷酸序列保守区域差异分别为1 bp和15 bp;延展后所得核苷酸序列差异分别为11 bp和24 bp。
7、进行了大肠杆菌和酿酒酵母木糖异构酶基因工程菌的构建,获得了过表达的大肠杆菌转化子,为纤维素酒精生产工程菌的构建奠定了一定实验基础。