论文部分内容阅读
唇形科(Lamiaceae)香茶菜属（Isodon）植物疏花毛萼香茶菜（Isodon eriocalyxvar.laxiflora）含有丰富的对映-贝壳杉烷类二萜成分，并且多具生物活性。其中，从该植物叶片中分离得到的毛萼乙素(eriocalyxin B)具有极好的抗肿瘤活性。我们推测该类化合物的生物合成途径，由焦磷酸香叶基香叶酯(geranylgeranyldiphosphate，简称GGPP)先后经二萜合酶对映-CPP合酶（ent-copalyl diphosphatesynthase，简称ent-CPS）和对映-贝壳杉烯合酶（ent-kaurene synthase，简称ent-KS）催化生成对映-贝壳杉烯（ent-kaurene），之后在对映-贝壳杉烯氧化酶（ent-kaurene oxidase，简称ent-KO）等后修饰酶的作用下，形成多种多样的二萜化合物。 论文第一章，根据转录组测序结果从疏花毛萼香茶菜的叶片克隆得到一条类似于贝壳杉烯合酶基因KS的全长序列（命名IeKS1），并对该基因连同前期工作中克隆得到的另两条可能的KS基因（IeKS2和IeKS3）进行了异源表达和重组酶的催化活性研究。3个IeKS基因的异源表达在大肠杆菌中进行，将IeKS基因全长及去信号肽编码区的序列构建到表达载体pET32a(+)中，并先后转入到BL21(DE3)和Rosetta-gamiTMB(DE3)两种宿主菌内进行诱导表达，通过改变诱导温度、IPTG浓度等条件，实现了重组酶的可溶表达，并通过亲和层析对重组酶进行了初步纯化。在此基础上，采用立体特异性已确定为ent-型的IeCPS2与IeKS重组酶进行酶偶联反应，以GGPP为初始底物，通过GC-MS检测目标产物ent-kaurene的方法对IeKS的催化活性进行鉴定。结果表明，当全长以及去信号肽IeKS1分别与IeCPS2配对进行酶联反应时，均检测到产物ent-kaurene，从而证实IeKS1酶催化的立体特异性为对映型，IeKS1是一个对映-贝壳杉烯合酶基因。此外，当IeKS2、IeKS3及其去信号肽蛋白分别与IeCPS2酶联反应时，均未检测到ent-kaurene，其催化产物还有待进一步确定。 论文第二章，利用酵母表达系统pYES2/INVSc1对疏花毛萼香茶菜中两个可能的KO基因(IeKO1、IeKO2)及拟南芥赤霉素合成途径中已知功能的ent-KO基因(AtKO)进行异源表达和功能鉴定。首先利用大肠杆菌构建了3个KO基因的酵母表达载体，经测序验证序列正确后转化到酵母宿主菌中，并在SC-U-Gal培养基中诱导表达。以ent-kaurene为底物，通过静息细胞饲喂和粗酶转化、LC-MS检测及标准品比对，同时，利用阳性对照AtKO确定酵母表达体系的可靠性以及酶活性检测方法。实验结果初步表明，IeKO2可能具有与AtKO一样的催化活性，即催化ent-kaurene的C19位氧化，生成ent-kauren-19-oic acid，但IeKO1未检测到该产物。因此推测IeKO2很可能参与赤霉素的生物合成，而IeKO1的功能尚不能确定。 论文综述部分对毛萼香茶菜和疏花毛萼香茶菜中二萜化合物的氧化位点进行统计分析，并对可能的氧化规律、ent-kaurene的首步氧化、以及对映-贝壳杉烷类二萜化合物的后修饰途径进行了初步探讨。