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V型ATP酶(V-H<+>-ATPase)是一类重要的膜转运蛋白,主要分布在真核细胞的内膜系统上,包括内吞小体、高尔基体、溶酶体、转运囊泡及酵母和植物细胞的液泡上.它利用水解ATP产生的能量,实现质子的跨膜转运.V-ATPase结构上与细胞内另一类参与能量转化的ATPase-ATP合酶(ATP synthase,F-ATPase)非常相似.迄今V-ATPase的三维结构尚未解析成功.该论文用单颗粒电镜显微术研究绿豆V-ATPase的结构,取得了以下研究结果:1、从绿豆下胚轴(豆芽)中分离纯化了液泡H<+>-ATPase(V-H<+>-ATPase).较之液泡膜,纯化的V-ATPase水解活性提高了10.5倍.SDS-PAGE显示它除了包含已报道的绿豆V-ATPase的所有亚基(分子量分别是100,68,57,51,44,38,37,32,16,13,12 kDa)外,还包含一条40kDa的多肽.生化实验表明该条多肽是V<,0>的亚基.用串联质谱鉴定出它与拟南芥V-ATPase的d亚基高度同源.通过尝试不同的去污剂,找到了样品分子在电镜下呈现均一分散状态的条件.2、用图像处理软件分析了约6000个绿豆V-ATPase的负染单颗粒图像.图像的总平均(total average)揭示绿豆V-ATPase整体结构呈"哑铃形",包括一个水溶性的头部(V<,1>)和一个膜结合的基部(V<,0>),V<,1>和V<,0>通过柄区(stalk area)连接.整个分子大小为25×13.7nm,柄区高6nm,这比F-ATPase大很多,但与其它真核V-ATPase很接近.经MSA(multivariate statistical analysis)分类得到的二维投影图反映了分子在碳膜上不同的"取向(orientation)".在V<,1>上可以区分三种密度:小球形(knob)、弧形(arc)、长条形(spike).在柄区可以清楚区分一个中央柄(central stalk)和至少两个外周柄(peripheral stalk).3、用KI和ATP处理绿豆液泡膜微囊,使V-ATPase水溶性的V<,1>部分从液泡膜上解离.再经离子交换和分子筛层析分离得到V<,1>亚复合物.SDS-PAGE显示该亚复合物主要包含A亚基(68kDa)、B亚基(57kDa)和E亚基(38kDa).电镜单颗粒分析结果表明,在side view中A<,3>B<,3>异六聚体正下方存在一个明显的蛋白密度,在top view中同样大小的蛋白密度存在于A<,3>B<,3>异六聚体的中央.结合亚复合物的亚基组成.认为该蛋白密度对应E亚基.4、绿豆V-ATPase的V<,0>包括a亚基(100kDa)、d亚基(40kDa)和c亚基(16kDa).d亚基是一个可溶性的亚基,与V<,0>的其它亚基(a和c)结合在一起.在不同的条件下处理液泡膜微囊,可得到包含或不含d亚基的V<,0>亚复合物.将这两种成分不同的V<,0>亚复合物重组到人工制备的脂质体上,发现不含d亚基的V<,0>可以在膜电势驱动下被动转运质子;而包含d亚基的V<,0>则不可能.从而提出d亚基具有控制c亚基被动转运质子的功能.