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人参为五加科多年生草本植物,是一种珍贵的中药材。人参皂苷是人参中主要的次生代谢产物,具有多种药理作用,如提高免疫力、改善疲劳、抗衰老和抗肿瘤等,被广泛应用于医药保健、美容化妆品和食品等行业,因此人参皂苷具有广阔的应用前景及可观的经济价值。但野生人参资源较为匮乏,栽培周期较长,易受病害侵袭,种植技术要求较高,尤其是人参皂苷的含量较低,因此对人参的开发利用受到一定限制,难以满足社会需求。研究表明,外界刺激因子(如非生物胁迫、外源激素处理等)能够通过激活细胞信号转导通路,将信号传递给胁迫应答转录因子,调节一系列相关关键酶基因的表达,影响次生代谢产物的合成,从而使植物产生胁迫耐受。本研究讨论了在盐胁迫、低温胁迫、外源MeJA和ABA等非生物因素处理下,人参转录因子基因WRKY、ERF、MYB以及人参皂苷生物合成途径中3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶基因(HMGR)、达玛烯二醇合成酶基因(DS)、原人参二醇合成酶基因(D12H)、原人参三醇合成酶基因(P6H)、原人参二醇三羟基一葡萄糖基转移酶基因(UGT-D-3OH-1)、原人参二醇三羟基二葡萄糖基转移酶基因(UGT-D-3OH-2)、原人参二醇二十羟基葡萄糖基转移酶基因(UGT-D-20OH)的表达情况,并分析比较了4种不同处理条件、3个人参转录因子基因、7个人参皂苷生物合成关键酶基因三者之间的关系。进行如下研究:(1)成功克隆得到人参转录因子WRKY1基因的CDS序列,并将其命名为Pg WRKY1。测序结果显示,PgWRKY1基因序列长度为1077 bp,可以编码358个氨基酸。序列比对结果表明,PgWRKY1与西洋参PqWRKY1的核苷酸序列相似性为99.16%,氨基酸序列相似性为98.32%。将相关信息提交至GenBank,获得检索号为KU836935。(2)成功克隆得到人参转录因子ERF1基因的CDS序列,并将其命名为PgERF1。测序结果显示,PgERF1基因序列长度为936 bp,可以编码311个氨基酸。序列比对结果表明,PgERF1与西洋参PqERF1的核苷酸序列相似性为98.29%,氨基酸序列相似性为97.75%。将相关信息提交至GenBank,获得检索号为KU935742。(3)完成了PgHMGR、PgDS、PgD12H、PgP6H、PgUGT-D-3OH-1、Pg UGT-D-3OH-2、PgUGT-D-20OH、PgMYB、PgWRKY1、PgERF1基因核心片段的克隆。电泳检测结果初步表明,PCR反应程序设置比较合适,所用引物的准确性和特异性较好。(4)在低温胁迫和MeJA处理下,7个关键酶基因的表达量均上调;在盐胁迫下,PgHMGR、PgP6H、Pg UGT-D-20OH基因表达量上调,PgD12H的表达量变化不明显,PgDS、PgUGT-D-3OH-1、PgUGT-D-3OH-2表达量下调;在ABA处理下,7个关键酶基因的表达量均下调。(5)在低温胁迫下,转录因子基因PgMYB和PgERF1的表达量均上调,Pg WRKY1的表达量变化不明显;在盐胁迫下,3个转录因子基因的表达量均上调;在MeJA处理下,PgMYB和PgWRKY1的表达量上调,而PgERF1基因的表达量下调;在ABA处理下,PgWRKY1和PgERF1的表达量均上调,而PgMYB基因的表达量下调。(6)采用香草醛比色法进行人参发根总皂苷含量的测定,检测结果显示,与对照组(未经处理的)相比,经MeJA处理、低温胁迫、盐胁迫处理的人参发根总皂苷含量分别提高了约50%、17%、8%,而经ABA处理的总皂苷含量降低了约9%。(7)推测转录因子和关键酶之间的关系:PgMYB与PgD12H基因之间可能存在正相关关系,PgERF1与PgUGT-D-3OH-1、PgUGT-D-3OH-2基因之间可能存在负相关关系。