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干旱不仅是制约我国农业发展的重要因素,同时也已成为全球发展和稳定所面临的重大问题。水稻是农业生产中的用水大户,占农业用水总量的65%以上。因此,培育抗旱节水且高产优质的水稻新品种是我国发展节水农业的重要内容。通过发掘水稻抗旱基因,揭示水稻抗旱分子机制,培育节水抗旱稻则是水稻抗旱育种的一条有效途径。
克隆了10个位于水稻第4染色体抗旱QTL区段内的候选基因,其中7个基因(Cg1,Cg.5,Cg11,Cg12,Cg16,Cg19,Cg41)构建了超表达载体,并利用农杆菌介导的方法成功转化水稻中花11,分别获得了118棵,165棵,223棵,46棵,90棵,89棵,189棵独立转化植株。对部分转基因植株(T0).进行了目的基因的表达量检测,以及Southern blot拷贝数检测,分别获得Cg5,Cg11,Cg12,Cg16,Cg19,Cg41的单拷贝植株15,10,8,5,17,47份,表达量分别达到对照植株的20,40,20,80,10,100倍以上。
OsGRAS1基因的克隆及生物信息学分析。从IRAT109 cDNA中克隆到了OsGRAS1基因序列,全长为1911bp。根据全长cDNA推导出水稻OsGRAS1蛋白共有636个氨基酸残基,分子量为71575道尔顿,预测等电点(pI)为5.39。在C端261-633处发现明显的GRAS结构。对粳稻中已发现的所有57个GRAS家族成员进行聚类分析,发现OsGRAS1预测为SCL9。
OsGRAS1构建了两个超表达载体,并转化水稻,分别获得105株和84株阳性植株。qRT-PCR检测显示,有11个的表达量超过40倍(CaMV35Somega启动子),和8个的表达量超过20倍(CaMV35S启动子)。Southern blot分析表明两种载体各有22和23个单拷贝株系。
OsGRAS1基因在苗期和幼穗分化期干旱处理后,表达量均有明显提高。对苗期的IRAT109进行干旱处理0.5h,3h,8h,20h,分别对OsGRAS1在叶中及根中的表达进行分析。OsGRAS1基因在叶中的表达量在0.5h时有所下降,其后呈上升趋势,并且在干旱胁迫处理20h时达到最大。在根中的表达一直呈上升趋势,并且在干旱胁迫处理8h时达到最大。对幼穗分化期进行干旱处理2周和4周,分别对OsGRAS1在叶、根及穗中的表达进行分析,发现干旱处理后在叶、根、幼穗中表达量均有明显提高,表达量最高时都能达到水处理的5-7倍。
OsGRAS1启动子序列克隆及顺式作用元件预测。从IRAT109基因组DNA中扩增得到了OsGRAS1基因上游启动子序列,全长为1332bp,命名为OsGRAS1P。对OsGRAS1P进行转录起始位点预测,发现转录起始位点可能位于377bp-427bp之间。顺式作用元件分析发现该序列具有典型的真核生物核心启动子区域,并且包含多个与干旱胁迫相关和激素应答的调控元件:(1)脱水、ABA响应元件MYBCORE和MYB1AT;响应脱水、ABA、冷、光的元件MYCCONSENSUSAT;伤害响应元件OSE2ROOTNODULE;病程响应顺式元件W-box;早期脱水应答基因表达有关的元件ACGTATERD1等;(2)与生长素、水杨酸、茉莉酸引起的转录激活有关的元件ASF1MOTIFCAMV; ABA、赤霉素和糖响应顺式作用元件PYRIMIDINEBOXHVEPB1等。
OsGRASlP启动子序列多样性分析及其对下游基因表达水平的影响。在120份稻种资源中对OsGRASl启动子片段进行序列多样性分析,发现存在4种不同类型的启动子序列。其中,Ⅳ型OsGRASl启动子比其它三种类型多了3个顺式作用元件:MYBlLEPR,GTlCORE,NTBBFlARROLB。每种序列类型选取1份材料,进行冷、盐、外源ABA和PEG胁迫处理,分析其下游基因OsGRAS1的表达水平。结果表明,Ⅳ型材料的启动子对ABA和PEG处理较其余三种类型更敏感。