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改良棉纤维品质和提高棉花产量是棉花育种的主要目标。为此,需要进行棉纤维发育及相关基因表达调控的研究,获得候选基因。用cDNA膜阵列的方法获得了14个在纤维细胞中高表达的基因,其中一个基因编码的是S-腺苷高半胱氨酸水解酶,它是依赖于S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的转甲基途径的关键酶,催化S-腺苷高半胱氨酸形成腺苷和高半胱氨酸。S-腺苷甲硫氨酸是生物体甲基的重要供体,甲基转移到DNA、RNA、蛋白质和一些磷脂类小分子后成为S-腺苷高半胱氨酸;S-腺苷高半胱氨酸是甲基转移酶的抑制剂,所以该化合物的去除有利于转甲基反应。 棉花栽培品种徐州142编码S-腺苷高半胱氨酸水解酶(GhSAHH)的基因有两个拷贝,RT-PCR表明GhSAHH1在纤维细胞中高表达,尤其是在纤维细胞的快速伸长期高表达。在棉纤维中还检测到腺苷激酶(GhADK1)的高表达,其表达特征与GhSAHH1非常相似。以棉花串联重复序列5S rDNA为探针,Southern杂交显示,与叶片和胚珠等组织的DNA相比,棉纤维细胞DNA甲基化程度明显增高。这一结果提示纤维细胞甲基化代谢相关基因的上调与基因组DNA的高甲基化呈正相关性。 由于棉花转化周期比较长,遗传背景较复杂,所以用模式植物拟南芥来研究SAHH的功能。拟南芥基因组有两个基因编码SAHH,AtSAHH1和AtSAHH2,相互间氨基酸水平的一致性(identity)达到95%,它们与棉花GhSAHH1的一致性也分别达到了93%和91%。以绿色荧光蛋白GFP构建融合蛋白发现棉花和拟南芥SAHH蛋白在洋葱表皮细胞定位相同,蛋白信号主要在细胞质,在细胞核内也能检测到信号。在转基因拟南芥根中也观察到SAHH细胞质定位。为了检测拟南芥两个SAHH基因的表达区域,分别构建了SAHH基因启动子融合GUS的载体。 GUS染色表明AtSAHH1主要在根、子叶、叶片的叶脉、萼片和花丝表达,而AtSAHH2主要在叶片表皮毛、下胚轴和花药中表达,染色结果表明这两个编码基因表达区域不重复,而且呈互补模式。 从SALK获得了AtSAHH1基因T-DNA插入突变体,命名为sahh1-1,过表达棉花或拟南芥的SAHH1基因均可互补插入突变体表型。测序发现T-DNA插入在AtSAHH1翻译起始点前82bp的位置,杂合突变体与野生型表型相似,但是纯合突变体有多种表型变化,包括叶片颜色较绿,开花和衰老延迟,根较短,这些表型变化与细胞分裂素过表达植物有一定相似。sahh1-1和proSAG12∷IPT植物叶绿素含量也比野生型植物高,Northern杂交发现叶绿素合成相关基因GUN5(镁离子螯合剂)的表达也提高。用甲基化敏感的酶消化DNA,与拟南芥串联重复序列5S rDNA和180bp的中心粒片段杂交,结果表明sahh1-1突变体中基因组甲基化水平较低。体外酶活实验以及互补插入突变体表型表明拟南芥和棉花SAHH功能相同。 利用双链RNA的方法,降低拟南芥SAHH1和SAHH2表达,转基因植物出现叶片皱缩,变绿和多分枝,并且内源细胞分裂素合成基因表达增多。sahh1-1和双链RNA转基因植物种子中果胶成分的甲基化程度也降低。Northern杂交发现甲基转移途径的基因如AtSAHH1和AtADK1表达受细胞分裂素诱导,而腺嘌呤和腺嘌呤核苷不影响这两个基因的表达。在体外腺嘌呤明显抑制SAHH的催化活性,而具有腺嘌呤结构的细胞分裂素并不影响SAHH的活性。 一方面,在SAHH基因表达水平明显降低的转基因植物中,内源细胞分裂素合成酶基因表达水平增高。另一方面,细胞分裂素又能诱导SAHH基因的表达,这种诱导不依赖于嘌呤结构,而与细胞分裂素信号途径有关。这些结果说明,细胞中依赖于SAM的甲基化途径与细胞分裂素的合成与信号传导途径存在相互交叉(cross-talk)。