论文部分内容阅读
创制突变体是植物基因功能研究和遗传改良的重要手段。小麦是异源六倍体，通过传统的生物技术方法很难对其多个拷贝的基因进行同时突变，而随着小麦基因组测序的逐步完成，很有必要建立一种高效的基因组改造技术手段来加速小麦基因功能的解析以及新品种的培育。基因组编辑技术(Genome editing)是目前最具潜力的基因工程技术，它是利用序列特异性核酸酶(Sequence-specific nuclease，SSN)在基因组的特定位点造成DNA双链断裂(Double strand break，DSB)，通过细胞自身修复机制——非同源末端连接(Non-homologous end joing，NHEJ)或同源重组(Homologous recombination，HR)实现基因的定点敲除、删除、替换和插入。本研究在普通小麦中成功建立了高效的TALEN和CRISPR/Cas9基因组编辑技术体系，并利用此技术体系对小麦重要的农艺性状进行了改良。 首先，建立了TALEN介导的小麦基因组编辑技术体系，利用Golden GateAssembly构建方法对小麦中的4个基因LOX2、VRN3、PDS和MLO进行构建TALEN。经过小麦原生质体瞬时表达检测系统验证了其活性，突变效率为5.8-38.0％;转基因苗中的突变效率为3.4-6.7％。此外，建立了CRISPR/Cas9系统对小麦基因组编辑的技术体系，首先以植物密码子的偏好性优化SpCas9(Streptococcus pyogenes Cas9)，并在其两端各加入一个核定位信号(NLS)序列，利用玉米的Ubiquitin1启动子进行启动;利用小麦自身的小核RNA启动子U6转录sgRNA，构建了小麦CRISPR/Cas9表达载体Ubip∷NLSCas9和TaU6p∷sgRNA。以小麦MLO-A1基因和LOX2基因为研究对象，CRISPR/Cas9系统在小麦原生质体中的突变效率达到35.0-43.0％，转基因小麦植物中的突变效率达到4.5-77.6％。另外，我们通过NHEJ途径实现了DNA的定点插入，其中将GFP插入到MLO基因TALEN的靶位点处，原生质体中的效率达到6.5％;而将含有标签的ssDNA同TALEN转入到小麦幼胚中，T0代植物中定点插入的效率达到1.6％，且能稳定传递到后代。同时我们通过HR途径在小麦原生质体中实现了MLO基因靶位点处碱基的定点插入。 为了将小麦基因组编辑技术体系真正应用到小麦重要的农艺性状改良上，我们选取小麦抗白粉病相关基因MLO为研究对象，在三个拷贝MLO基因的保守区设计3对TALEN，通过小麦原生质体瞬时表达检测系统验证并筛选有活性TALEN，用基因枪转化法转入小麦未成熟胚中。T0代转基因植物中获得了在三个基因组上对MLO基因同时或分别敲除的杂合突变体，其中在科农199品种里的效率达到6.0％，在Bobwhite品种里的效率达到3.4％。T0代突变体经过一代或两代的自交，获得了小麦MLO基因的所有纯合突变类型(tamlo-aaBBDD, tamlo-AAbbDD，tamlo-AABBdd, tamlo-aabbDD，tamlo-aaBBdd, tamlo-AAbbdd, tamlo-aabbdd)。离体和活体接菌实验表明:只有tamlo-aabbdd三突植物对小麦白粉病具有显著的抗病性，而且这种抗性可以稳定遗传到后代。这个实验表明，多拷贝的MLO基因在功能上存在冗余效应，只有将所有拷贝的MLO基因进行功能缺失突变才会对白粉病具有抗性，这也是到目前为止利用传统的生物技术手段没有获得小麦mlo基因突变体的主要原因。此外，我们通过后代分离法获得了无转基因痕迹的抗白粉病小麦mlo的突变体，说明基因组编辑技术修饰过的植物具有很高的生物安全性。 本研究利用TALEN和CRISPR/Cas9系统在六倍体小麦里建立了高效基因组编辑技术体系，主要包括靶位点设计、活性检测、遗传转化以及突变体检测四部分。首次在多倍体物种中证明基因组编辑技术不仅可以同时并准确地对多个部分同源的基因进行改造，而且可以特异的对单个拷贝基因进行编辑。此外，创制的小麦mlo突变体具有持久、广谱抗白粉病的优点，为小麦抗白粉病育种提供重要的起始材料。本研究工作为小麦基因功能的研究和分子育种提供了一个全新的思路和技术路线。