【摘 要】
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苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）是目前世界上应用最广泛的杀虫微生物之一。编码Bt杀虫蛋白的基因也作为最主要的杀虫蛋白基因转入到了多种重要的粮棉作物中（郭三堆,1995）。虽然转Bt作物能抵抗主要害虫,但它们仍然容易感染真菌病原性病害。β-1,3-葡聚糖酶是一种重要的植物抗性化合物。它可以抑制植物真菌病原体的生长和繁殖,将其转入转Bt植物中可以有效控制真菌病害
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苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）是目前世界上应用最广泛的杀虫微生物之一。编码Bt杀虫蛋白的基因也作为最主要的杀虫蛋白基因转入到了多种重要的粮棉作物中（郭三堆,1995）。虽然转Bt作物能抵抗主要害虫,但它们仍然容易感染真菌病原性病害。β-1,3-葡聚糖酶是一种重要的植物抗性化合物。它可以抑制植物真菌病原体的生长和繁殖,将其转入转Bt植物中可以有效控制真菌病害。因此我们构建了苏云金芽孢杆菌crylAc和β-1,3-葡聚糖酶的融合基因Ac-cmg1,并打算开发这一转融合基因水稻。主要实验结果如下: 1.设计带有酶切位点特异性引物,以pCR2.1-cry1Ac质粒DNA为模板,PCR扩增出cry1Ac基因。PCR产物经NdeⅠ/HindⅢ双酶切,再与同样经NdeⅠ/HindⅢ双酶切的pET-22b（+）载体连接,并转化到大肠杆菌中获得重组质粒pET-22b-Ac。 2.设计带有酶切位点特异性引物,以pGEM-T-CMG质粒DNA为模板,PCR扩增cmg1基因。PCR产物经HindⅢ/XhoⅠ双酶切,再与同样经HindⅢ/XhoⅠ双酶切的pET-22b（+）载体连接,并转化到大肠杆菌中获得重组质粒pET-22b-cmg1。 3.NdeⅠ/HindⅢ分别双酶切pET-22b-Ac和pET-22b-cmg1,回收cry1Ac片段及带有cmg1的载体大片段,二者连接并转化到大肠杆菌中获得融合基因重组质粒pET-22b-Ac-cmg1。 4.将三种原核表达质粒分别转化大肠杆菌Rosseta（DE3）中获得表达菌株。IPTG诱导后经SDS-PAGE检测表明三种表达菌株都有效表达出目的蛋白。 5.变性状态下Ni2+亲和层析纯化cry1Ac-6His、cmg1-6His蛋白,并分别以纯化后的cry1Ac-6His、cmg1-6His蛋白作为抗原,免疫雄性新西兰兔制备特异性多克隆抗血清。 6.分别用制得的抗血清对融合蛋白Ac-cmg1进行Westernblot检测,结果表明:pET-22b-Ac-cmg1表达了69.9kDa的cty1Ac蛋白,同时还表达了99.0kDa的葡聚糖酶蛋白。融合蛋白Ac-cmg1中cry1Ac蛋白和cmg1蛋白的表达得到证实。 7.对Ac-cmg1包涵体蛋白进行了复性的初步研究,并利用Ni2+亲和层析纯化了获得大量蛋白,为后续研究奠定基础。
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