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研究背景:近年来,以甲磺酸伊马替尼为代表的酪氨酸激酶抑制剂（TKI）的出现,改善了慢性粒细胞白血病（CML）患者的预后并且成为CML患者的首选治疗方案。但是,仍然有30%～40%的患者需要除TKI之外的其他治疗手段。伊马替尼耐药可以分为原发性耐药（对伊马替尼治疗无反应）和继发性耐药（伊马替尼治疗有效后疗效消失）。临床工作发现,有一部分伊马替尼原发性耐药的患者更换2代或3代TKI治疗过程中,丧失血液学反应（CHR）,主要表现为血小板数量降低,一般低于50×109/L,伴或不伴白细胞或红细胞数量的减少,且BCR-ABL融合基因的表达较高,染色体未恢复正常核型。骨髓穿刺细胞学检查提示原始细胞<5%,巨核细胞、血小板散在或偶见。此类患者的治疗方案多为TKI联合干扰素-γ（IFN-γ）、亚砷酸或者高三尖杉酯碱。最近,CML患者的免疫功能逐渐成为研究的热点,主要集中于对NK细胞、T淋巴细胞数量和质量、红细胞及相关细胞因子的研究。疾病的进展会影响内源性NK细胞的正常功能,导致NK细胞对肿瘤细胞的免疫监视不足。随着CML的进展,患者体内NK细胞的数量减少,对刺激的反应减弱,溶细胞毒性也受到损害。与缓解期的AML患者类似,CML患者TKI靶向药物治疗后获得主要分子学反应（MMR）时,NK细胞的溶细胞毒性恢复正常,在TKI停药的患者中,停药时NK细胞占百分比更高的患者预后更好,证明NK细胞参与了CML的免疫控制。含ITIM的受体对多种造血细胞的生物学活性起负调控作用,例如T细胞（CEACAM1受体）,巨噬细胞（SIRPa受体）和血小板（如PECAM-1受体）。而且,含ITIM的受体已证实可以促进癌细胞的增殖（例如PVR/CD155）或细胞凋亡（例如OXR1受体）。巨核细胞相关受体,G6B-b和TLT-1,均含有ITIM序列,与免疫系统的调节和血小板生成有关,目前尚未有关于TKI耐药CML患者免疫系统功能的研究以及巨核细胞相关受体G6B-b和TLT-1表达情况的报导,故本研究针对此类患者,研究其NK细胞的细胞毒性与正常供者的差异,以及目标受体的表达区别。目的:研究TKI耐药CML患者的NK细胞的细胞毒性与正常供者的区别,以及巨核细胞相关受体G6B-b,TLT-1的表达区别。方法:提取患者或健康供者的外周血单个核细胞,按照10:1的比例与K562细胞共培养6小时后,流式抗体标记CD3,CD45,CD16,CD56,CD107a,IFN-γ,TNF-α,应用Kaluza流式分析软件分析患者NK细胞CD107a和胞内因子的表达情况;应用蛋白免疫印迹法检测G6B-b,TLT-1蛋白的表达水平。结果:1.流式细胞术检测NK细胞毒性:在α=0.05检验水准下,CML患者组和健康供者组的NK细胞CD107a的表达均服从正态分布（W检验:P1=0.086,P2=0.189）不过两总体方差不齐（F=32.605,P<0.01）;采用校正t检验:t=7.389,v=15.329,P<0.01。结果表明:在α=0.05（双侧）检验水准下,可以认为两组之间NK细胞的细胞毒性不同,健康供者的NK细胞毒性高于CML患者,μ1-μ2的95%置信区间（3.66,6.62）。2.流式细胞术检测NK细胞分泌TNF-α功能:在α=0.05检验水准下,CML患者组和健康供者组的NK细胞分泌TNF-α的功能指标均服从正态分布（W检验:P1=0.888,P2=0.185）且两总体方差齐（F=2.968,P=0.094）;采用两独立样本t检验:t=-0.381,v=33,P=0.705。结果表明:在α=0.05（双侧）检验水准下,可以认为两组之间NK细胞分泌细胞因子TNF-α的功能无统计学差异,CML患者NK细胞分泌TNF-α的功能与健康供者NK细胞分泌TNF-α的功能相似。3.流式细胞术检测NK细胞分泌IFN-γ功能:在α=0.05检验水准下,CML患者组和健康供者组的NK细胞分泌IFN-γ的功能指标均服从正态分布（W检验:P1=0.955,P2=0.091）不过两总体方差不齐（F=4.289,P=0.046）;采用校正t检验:t=0.512,v=31.047,P=0.613。结果表明:在α=0.05（双侧）检验水准下,可以认为两组之间NK细胞分泌细胞因子IFN-γ的功能无统计学差异,CML患者NK细胞分泌IFN-γ的功能与健康供者NK细胞分泌IFN-γ的功能相似。4.Western Blot检测巨核细胞相关蛋白:取患者骨髓干细胞和健康供者外周血干细胞提取单个核细胞后加入含细胞因子的培养基诱导培养15日分选CD61+细胞后提取总蛋白。CML患者巨核细胞相关蛋白G6B-b及TLT-1的表达较健康供者降低,且具有显著统计学差异（P均<0.01）。结论1.此类TKI耐药CML患者的NK细胞溶细胞毒性受损,旨在提高NK细胞杀伤功能的治疗方案会使患者受益。2.CML患者NK细胞分泌细胞因子的功能未受到明显的抑制,但本研究未行NK细胞绝对计数,推测患者体内的NK细胞数量减少,因此患者仍需额外的细胞因子补充治疗。3.CML患者巨核细胞上G6B-b和TLT-1蛋白的表达弱于健康供者,而G6B-b和TLT-1蛋白与免疫系统调节和血小板生成相关,可能成为潜在治疗靶点。