【摘 要】
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氧化葡萄糖酸杆菌区别于其他微生物的不同之处就是其不完全氧化碳源底物的能力,工业应用广泛。通过现代生物技术对氧化葡萄糖酸杆菌进行遗传标记和改良,是研究和阐明其在生物
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氧化葡萄糖酸杆菌区别于其他微生物的不同之处就是其不完全氧化碳源底物的能力,工业应用广泛。通过现代生物技术对氧化葡萄糖酸杆菌进行遗传标记和改良,是研究和阐明其在生物催化中的作用,并进一步将其改造为基因工程菌的重要手段与有效途径。
本研究从基因工程的角度出发,利用绿色荧光蛋白作为报告基因的优良特性,将敲除了启动子的绿色荧光蛋白基因与广宿主型质粒pBBRMCS-5相结合,构建了一个用于氧化葡萄糖酸杆菌启动子筛选的探针质粒pBBR1MCS5-TFP。从G.oxydans M5基因组克隆到一系列启动子活性片段,根据荧光酶标仪检测的荧光强度确定所筛选重组子中最强的片段Lhp,对此片段进行了序列测定和分析。结果表明该片段与已知的氧化葡萄糖酸杆菌序列同源性高达43％,序列内有较为典型的-35区、-10区。将启动子后插入NADH还原酶Ⅱ基因,用于该基因在氧化葡萄糖酸杆菌中的表达,通过酶活测定检测到NADH氧化活性,表明筛选到的启动子片段具有良好的启动基因转录的功能,同时也实现了NADH还原酶Ⅱ基因在氧化葡萄糖酸杆菌的组成型过量表达。
由于NADH还原酶Ⅱ在氧化葡萄糖酸杆菌呼吸链中是唯一的NADH:Q还原酶,因此是筛选新的抑制剂及抗生素的优良靶点,本研究在完成NADH还原酶Ⅱ在氧化葡萄糖酸杆菌中的同源表达之外,将NADH:Q还原酶Ⅱ基因克隆到pET-28a+载体,转入大肠杆菌B121(DE3)中进行异源表达,并优化表达条件,以获得大量纯度较高的有NADH氧化活性的蛋白,为后续的酶学性质及氧化葡萄糖酸杆菌呼吸链的研究奠定基础。最终,在最适的表达条件(25℃、0.4 mM IPTG、10 h)下,从500mL的培养基中得到了62mg純化的NADH还原酶Ⅱ。
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