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研究背景:脓毒症(sepsis)是指由感染、创伤等因素引起微生物侵入机体而引发的全身性炎症反应。在发病过程中，淋巴细胞凋亡是导致机体免疫功能异常的重要原因之一。微小RNAs(miRNAs)是一类内源性的非编码小RNA分子。我们前期研究发现在人类体液中的一类循环miRNAs，可以作为脓毒症诊断与预后评估的生物学标记物。然而，其淋巴细胞功能变化在脓毒症疾病发生发展过程中的作用需要深入研究。 目的:本研究在前期发现具有临床价值的miR-223、miR-15a、miR-16基础上，对miR-223、miR-15a、miR-16调控免疫细胞的作用机制进行探讨。本课题以淋巴细胞作为介质和着入点，研究miR-223、miR-15a、miR-16对淋巴细胞增殖与凋亡的影响，以期揭示miRNAs对脓毒症疾病免疫失衡发生发展的相关作用机制，为脓毒症治疗寻找新的靶点。 方法:本研究所用临床标本来自中国人民解放军总医院的急诊监护病房(EICU)、外科重症监护病房(SICU)和呼吸科重症监护病房(RICU)，留取标本时间为2014年7月至2015年3月之间。脓毒症患者根据病情严重程度划分为脓毒症组、严重脓毒症组和脓毒症休克组。应用流式细胞术(FlowCytometry, FCM)分选单核、淋巴、中性粒细胞，实时荧光定量PCR(RealTime-PCR, RT-PCR)技术检测各分组全血自细胞及单核、淋巴、中性粒细胞内miRNAs差异表达。本实验所用Jurkat T细胞株购自中国医学科学院基础医学研究所（协和细胞库）。利用miRNAs激动剂及拮抗剂分别构建miR-223、miR-15a、miR-16过表达与敲除瞬时转染细胞系，Western blot技术检测转染后细胞内目的蛋白表达的差异，MTT细胞增殖与毒性实验检测细胞增殖活性。FAS刺激性抗体刺激细胞凋亡，流式细胞术检测细胞周期及凋亡。采用SPSS20.0软件对相关实验数据进行统计学分析。应用GraphPad Prism5.01绘图。 结果:1）本研究发现，sepsis组（158例）外周血白细胞内miR-223的表达量显著高于健康对照组（36例），差异有统计学意义(P＜0.0001);分选单核、淋巴、中性粒细胞（其中健康对照组3例，脓毒症患者组9例），脓毒症组患者淋巴细胞内miR-223表达水平显著增高，提示研究miR-223在淋巴细胞内的作用机制更具有临床意义。流式细胞术分选脓毒症患者外周血淋巴细胞（23例），淋巴细胞内miR-223的表达与淋巴细胞凋亡呈正相关。2）转染Agomir223的细胞OD值显著低于对照，转染Antagomir223的细胞OD值显著高于对照，差异有统计学意义(P＜0.05)。证明miR-223有抑制细胞增殖的功能。Agomir-223组G1期与S期细胞数的比值显著降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。证明miR-223对Jurkat淋巴细胞有周期阻滞的作用。3）Western blot技术检测细胞内周期蛋白的表达:miR-223激动剂组Cyclin D1表达下调，p21表达上调。拮抗剂组呈相反的趋势。4）取脓毒症患者外周血全血培养，转染Antagomir-223较对照组早期细胞凋亡比例均降低。5）sepsis组外周血白细胞内miR-15a/16的表达量显著高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)，septic shock组miR-15a/16的表达量显著高于sepsis组，差异有统计学意义(P＜0.05)。检测脓毒症患者第1、3、5、7、10、15天外周血白细胞内miR-15a/16的表达量。实验结果示:miR-15a在生存组呈逐渐下降的趋势，死亡组呈增高趋势，第7、10、15天差异有统计学意义。miR-16在生存组呈逐渐下降的趋势，死亡组呈增高趋势，第1、7、10、15天差异有统计学意义。6）用FAS刺激性抗体刺激，利用MTT细胞增殖与毒性检测试验结果显示:转染Agomir15a/16的细胞OD值显著低于对照，转染Antagomir15a/16的细胞OD值显著高于对照，差异有统计学意义(P＜0.05)。证明miR-15a/16有抑制细胞增殖的功能。利用流式细胞术检测各组细胞凋亡比例，转染Agomir15a/16的细胞凋亡比例显著高于对照，转染Antagomir15a/16的细胞细胞凋亡比例显著低于对照，差异有统计学意义(P＜0.05)。证明miR-15a/16有促进细胞凋亡的功能。7）在转染克隆有野生型FOXO1基因3UTR质粒的实验中hsa-mir-15a/16组与空白组相比较，FOXO1*P＜0.05差异显著(P=0.012)，hsa-mir-15a/16组与NC组相比，FOXO1*P＜0.05差异显著(P=0.010)，说明hsa-miR-15a/16能通过结合FOXO1基因3UTR影响其荧光活性改变。8）Western blot检测FOXO1蛋白，结果显示:FOXO1总蛋白表达无差异，磷酸化FOXO1在Agomir15a/16组均减弱，在Antagomir15a/16组均增强，说明miR-15a/16可降低非磷酸化FOXO1的表达，从而使得FOXO1发挥活性的部分增加，进而调控其下游凋亡相关的分子。9）Western blot检测FOXO1下游凋亡蛋白，FASL/TRADD/TRAIL在Agomir15a/16组均增强，在Antagomir15a/16组均减弱。 结论:1.脓毒症患者外周血白细胞内miR-223/15a/16高于健康对照。其中淋巴细胞内miR-223的含量与淋巴细胞凋亡正相关;白细胞内miR-15a/16可评估疾病的严重程度，其动态改变预示着患者的预后。2.MiR-223/15a/16均可促进FAS介导的Jurkat淋巴细胞凋亡，并抑制细胞增殖。3.MiR-15a/16可通过引起细胞内非磷酸化FOXO1比例降低，增强FOXO1的活性来促进细胞凋亡。