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近年研究发现了肠道菌群与多种疾病的关联作用。心血管疾病与肠道菌群的关系源于发现了失调的肠道菌群和菌群的代谢紊乱可能导致心血管疾病发展，其中关于肠道菌群以氧化三甲胺（Trimet hylamine-N-oxide，TMAO）为途径参与动脉粥样硬化的发现，是近年来肠道微生物组领域最重要的进展之一。一系列的研究证实了肠道微生物的代谢产物氧化三甲胺(TMAO)与心血管疾病的发生独立相关，该物质能促进动脉粥样硬化发展，进而导致心脑血管疾病风险增加。TMAO来源于饮食中卵磷脂、胆碱、甜菜碱、左旋肉碱等类似物，这些前体物质在肠道中经肠道菌群的作用下转化为三甲胺（TMA），TMA被吸收入血运送到肝脏，经黄素单加氧酶(FMO)催化氧化，生成氧化三甲胺（TMAO）。TMAO在循环系统积累，可显著降低胆固醇逆向转运效率，介导巨噬细胞吞噬脂肪成为脂肪细胞沉淀在血管壁，同时可使血小板过度活化，增加血栓形成风险，并加速凝血率，加剧血管动脉粥样斑块的进展，从而引起不良心脑血管事件发生。同时心血管疾病(CVD)是慢性肾病(CKD)病人面临的一个主要问题，临床研究发现慢性肾炎(CKD)病人的心血管疾病发生风险较高，虽然相关机制尚未有权威阐述，但一般认为尿毒素的积累会加重慢性肾病病人的肾功能和心血管疾病的风险。近年的研究发现慢性肾病病人较多出现肠道菌群失调，引起肠源性毒素的积累，从而引起系统炎性反应，加剧慢性肾病病人的肾脏功能损害和心血管损害，其中TMAO作为肠源性代谢物，其在慢性肾病患者的心血管疾病进程中的作用逐渐引起关注。 目前尚未见对中国人群的TMAO水平的相关报道，由于中国人群肠道菌群的差异性较大，TMAO作为一种新的心血管疾病的风险因子，还有很多值得我们去验证和探索之处，我们需要对中国不同人群的TMAO水平进行了解，探索TMAO的临床意义。 目的： 建立稳定高效准确的血液氧化三甲胺检测方法，以满足后续的研究需求。 阐明正常人群的血液氧化三甲胺水平及其与肠道菌群的关系，了解氧化三甲胺的人群分布特点，以及肠道菌群与氧化三甲胺水平的相关性，作为人群基准水平，为后续的病例对照研究建立研究基础。 探讨无症状颈动脉粥样斑块人群的血液氧化三甲胺水平及肠道菌群，分析颈动脉粥样斑块患者的氧化三甲胺和肠道菌群是否具有特征性变化。 分析慢性肾病人群的血液氧化三甲胺水平及肠道菌群，分析在肾脏排泄功能受损时，氧化三甲胺是否会在体内积累，进而增加慢性肾病患者心血管疾病的发生风险。 探索健康人群在高胆碱饮食后血液氧化三甲胺的变化情况，以及氧化三甲胺变化趋势是否与个体肠道菌群相关，根据肠道菌群进行饮食指导。 总体而言，通过对不同人群的肠道菌群及肠道菌群代谢物氧化三甲胺水平进行分析，了解氧化三甲胺的分布特点以及其与疾病状态的相关关系，为开展氧化三甲胺作为相关疾病风险因子之研究建立基础。 方法： 正常人群的研究对象为体检志愿者。 慢性肾病组(CKD)的研究对象为南方医院肾内科诊断的晚期慢性肾炎病人。纳入标准:1、肾脏结构或功能异常≥3月;2、GFR＜29ml/min/1.73 m2≥3月。根据年龄和性别匹配原则，选取32个同时期南方医院体检中心肾功能正常健康个体作为对照组，共纳入CKD病例组和对照组共32对，64人，年龄31-76岁。 胆碱饮食组的研究对象为年龄24-40岁健康成人。纳入标准:无疾病史（包括心血管、肾脏、肺部、内分泌疾病）、无感染性疾病，1个月内没有服用抗生素。志愿者共18人，其中男8人，女10人，年龄24-39岁。实验前一晚，志愿者避免食用含鸡蛋、鱼类和海鲜类食物。实验当天，志愿者采集空腹血样5mL和粪便样品后，空腹食用2个水煮蛋。8小时后，再采集静脉血5mL。 主要实验方法: 1.收集样品:收取空腹静脉血5 ml，常温3000 r/min离心10 min，抽取上清液保存在1.5 mlEP管，-40℃保存待测。新鲜粪便样品通过受检者自行用粪便采样管采集后放置-40℃待测。 2.建立快速检测血液TMAO方法，选用TMAO的稳定性同位素氘代TMAO（d9-TMAO）作为内标，使用高效液相色谱质谱仪进行检测; 3.使用磁珠法提取粪便样品中总DNA，针对16S rDNA V4片段使用带barcode的保守序列作引物进行特异性扩增; 4.高通量测序使用Illumina Hiseq2000平台进行双末端测序(paired-endsequence); 结果： 1.建立稳定同位素内标液质联用法，可快速检测血液中TMAO成分，灵敏度高，重复性好，准确度高，操作简便，适合科研和临床的大批量样品的检测。 2.正常人群中TMAO中值是2.66(1.48)μmol/L，呈偏态分布，个体差异大。 3.不同性别、不同年龄组间TMAO水平没有显著差异。 4.将TMAO含量分为4个水平，正常人群中42.54％的人TMAO含量处于在最低水平。不同水平间的传统心脑血管风险因子如体重、身体质量指数(BMI)、血压、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白、血糖、肌酐、尿酸等都没有明显差异。对TMAO与各因子进行Spearman相关性检验分析，发现TMAO与BMI有正相关趋势，相关系数是0.156，属于弱相关。TMAO与其他因子间未发现显著的相关性。 5.正常人群的肠道菌群可分为2型，分别是拟杆菌肠型(Bactero ides)和普雷沃氏菌肠型(Prevotella)，两个肠型间TMAO含量没有差异。 6.根据TMAO浓度分为4个水平进行分组比较肠道菌群，结果显示不同TMAO水平组间肠道菌群多样性和菌群结构没有显著差异，没有显现TMAO水平分布相关的菌群结构特征。 7.对肠道菌群进行OTU聚类分析，其中5个OTU与TMAO含量相关，OTU注释结果显示与TMAO含量正相关的OTU分别属于梭菌目(Clostridiales)下属的梭菌属(Clo stridiales)、考拉杆菌属(Phasco larctobacterium)、颤杆菌克属(Oscillibacter)和拟杆菌目(Bacteroidales)的Alistipes，负相关的OTU属于梭菌目(Clostridiales)的厌氧孢杆菌属(Anaerospo robacter)。 8.无症状颈动脉粥样硬化患者和正常对照组的体重、血压、血糖以及高密度脂蛋白都存在显著的差异，但是两组间的TMAO水平中值分别为2.82μmol/L和2.50μmol/L，没有显著差异。 9.颈动脉粥样硬化组和对照组的肠道菌群进行α多样性、β多样性分析、种属比较分析，结果显示两组的肠道菌群的多样性和菌属构成没有显著差异，通过多元统计分析LEfSE找到8个菌属在两组内分布具有显著差异 结论： 本课题建立了稳定同位素内标液质联用的血氧化三甲胺检测方法，可以稳定高效准确地检测血液氧化三甲胺水平。 正常人群中TMAO中值是2.66(1.48)μmol/L，正常人群中TMAO水平普遍处于低水平，个体间TMAO含量差异较大。不同性别、年龄间TMAO水平没有差异。TMAO水平与传统心血管风险因子没有显著相关关系，TMAO可能可以在更早期独立预测心脑血管患病风险。但目前暂时无法通过肠道菌群16SrDNA高通量测序结果来推断个体TMAO水平高低。 无症状性颈动脉粥样斑块病人的TMAO水平与正常人群TMAO水平相似，肠道菌群构成也没有显著差异，还需要做长时间的追踪记录以探索TMAO水平与心脑血管事件发生的相关性。 慢性肾病患者的TMAO水平显著高于健康对照，慢性肾病病人的肠道菌群失调现象与血液TMAO高水平可能起相互作用的效果，高TMAO水平可能是导致慢性肾病患者心血管事件发生风险高的原因之一。为降低TMAO水平和肠道菌群失调的状态，需要加强对慢性肾病患者的日常饮食指导。 根据个体的肠道菌群检测结果，可以预测该个体在高胆碱饮食后TMAO的变化趋势，降低由此引起心脑血管事件的风险。因此，肠道菌群有望作为预防心脑血管事件发生的靶标。 总体而言，目前研究结果不能支持氧化三甲胺和肠道菌群作为临床预测、诊断的指标，但具有为相关疾病患者提供饮食指导的意义。